МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ
УТВЕРЖДЕНА
приказом Министра здравоохранения Республики Казахстан
от 11 марта 2008 года № 131
АСТАНА 2008
Издано с разрешения Европейского Департамента качества
лекарственных средств и здравоохранения Совета Европы
(Страсбург, Франция).
Тексты, приведенные в общей части, подготовлены на основе текущего издания
Европейской фармакопеи.
Г 72 Государственная фармакопея Республики Казахстан. Т. 1. - Алматы:
Издательский дом «Жибек жолы», 2008. - 592 с.
ISBN 9965-759-97-9
ББК 52.81 (5 Каз)
ISBN 9965-759-97-9 - (Т. 1)
ISBN 9965-759-96-0
© Министерство здравоохранения
Республики Казахстан, 2008
© ИД «Жибек жолы», 2008
Министр здравоохранения
Республики Казахстан,
доктор медицинских наук А.Г. ДЕРНОВОЙ
УВАЖАЕМЫЕ КОЛЛЕГИ!
Перед Вами - первый том Государственной Фармакопеи Республики Казахстан. Необходимость ее создания
продиктована вступлением Казахстана на путь самостоятельного развития и активного продвижения . мировое
сообщество. Задача разработки национальных фармакопейных стандартов определена Законом Республики
Казахстан «О лекарственных средствах». Издание первого тома Государственной Фармакопеи представляет
один из важнейших результатов реализации Государственной программы реформирования и развития
здравоохранения республики, утвержденной Президентом Республики Казахстан Н. Назарбаевым.
Государственная Фармакопея Республики Казахстан устанавливает тот уровень качества и безопасности
лекарственных средств, который государство гарантирует своим гражданам. И это вполне понятно, так как
лекарственные средства относятся к категории объектов национальной безопасности и поэтому являются
предметом пристального внимания и заботы со стороны государства.
Считаю, что главной задачей фармакопеи является обнаружение брака и фальсификации лекарственной
продукции. С введением в действие она явится эффективным инструментом в обеспечении качества и
безопасности лекарственных средств как при их производстве, так и при медицинском применении.
Искренне поздравляю авторский коллектив и всю фармацевтическую общественность страны со значительным
событием в развитии отечественной фармацевтической отрасли и выражаю уверенность в том, что внедрение
Государственной Фармакопеи Республики Казахстан будет способствовать осуществлению задач, поставленных
перед общественным здравоохранением.
УВАЖАЕМЫЕ КОЛЛЕГИ!
Целью Государственной Фармакопеи Республики Казахстан является создание единообразного подхода в
координации и совершенствовании контроля качества лекарственных средств на территории Республики
Казахстан, путем утверждения единых стандартов, гармонизированных с международными, в частности с
Европейской Фармакопеей.
Государственная Фармакопея - это фундамент системы обеспечения безопасности и качества фармацевтической
продукции на рынке Казахстана.
Сегодня выполнен только первый этап огромной работы по стандартизации лекарственных средств в Казахстане,
намечены реальные шаги и меры по скорейшей реализации данного проекта.
Государственная Фармакопея - это один из инструментов защиты рынка от продукции сомнительного качества
и различного рода фальсификаций, и как следствие - обеспечение высокого качества лекарственных средств,
поступающих на отечественный рынок.
Работа над Государственной Фармакопеей Республики Казахстан осуществлялась научным коллективом
РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств» при поддержке Министерства здравоохранения
Республики Казахстан, Комитета фармацевтического контроля, с участием ряда научно-исследовательских
институтов и лабораторий Российской Федерации, Украины, республиканских ведомств, отечественных
предприятий фармацевтической промышленности.
Издание 1 •ca Фармакопеи Республики Казахстан - это только начало большого пути по обеспечению
государственной политики в области качества лекарств. И весьма важным моментом на этом пути является ее
целевое применение всеми участниками фармацевтического рынка в контексте обеспечения качества,
эффективности и безопасности лекарственных средств на благо здоровья населения.
Генеральный директор РГП
«Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий
медицинского назначения
и медицинской техники» Г.Д. БЕРДИМУРАТОВА
УВАЖАЕМЫЕ ПОЛЬЗОВАТЕЛИ
ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАКОПЕИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН!
В настоящее время фармацевтический рынок Республики Казахстан насчитывает около семи тысяч наименований
лекарственных средств. Их качество должно быть регламентировано сводом государственных стандартов и
положений - Государственной Фармакопеей Республики Казахстан (ГФ PK). ГФ PK является отражением того
уровня качества и безопасности лекарственных средств, который государство гарантирует своим гражданам.
Создание ГФ PK является важным достижением суверенного Казахстана, проявлением заботы государства о
здоровье населения. Оно имеет важное социальное, экономическое и научное значение, так как благодаря
установленным стандартам:
позволит обеспечить высокое качество лекарственных средств, поступающих на фармацевтически рынок
республики;
явится одним из инструментов защиты фармацевтического рынка страны от продукции сомнительного
качества и различного рода фальсификаций;
явится фактором, стимулирующим внедрение требований надлежащей производственной практики в
отечественную фармацевтическую промышленность;
будет способствовать развитию научных исследований по созданию оригинальных лекарственных
средств, в том числе из отечественного сырья.
Первое издание ГФ PK подготовлено Республиканским государственным предприятием «Национальный центр
экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан.
Процесс создания ГФ PK был начат с определения концепции, принципов и подходов, положенных в ее основу.
В качестве главного ориентира при создании ГФ PK были приняты требования Европейской Фармакопеи. Создание
ГФ PK охватывало этапы разработки, трехкратного рецензирования, перевода на государственный язык
и тщательного редактирования фармакопейных статей. Корректность частных фармакопейных статей (монографий)
на готовые лекарственные средства определялась путем валидации методик испытаний и последующей их
апробации в аккредитованных испытательных лабораториях.
Перечень лекарственных средств, требующих разработки монографий, был определен на основе следующих
факторов:
> значительная доля присутствия лекарственных средств на фармацевтическом рынке республики;
Ir многочисленность торговых наименований одного лекарственного средства;
г перечень лекарственных средств для лечения социально-значимых заболеваний.
Монографии, относящиеся к воспроизведенным (генерическим) лекарственным препаратам, были отработаны
на основе сравнительного анализа их качества и установления фармакопейного уровня требований к ним,
проведенных с высокой степенью скрупулезности. Каждая статья представляет собой результат острых профессиональных
дискуссий на заседаниях Фармакопейной комиссии, а также широкого обсуждения фармацевтической
общественностью.
В создании ГФ PK принимало участие большое число специалистов из многих научных, образовательных и
практических учреждений и организации фармацевтического профиля Республики Казахстан. Неоценимая помощь
оказано ведущими специалистами Государственного предприятия «Научно-экспертный фармакопейный
центр» Украины, Института стандартизации и контроля качества лекарственных средств Министерства здравоохранения
Российской Федерации, активно принимавшими участие практически на всех этапах работы, начиная
от определения концепции создания ГФ PK до разработки материала. Большую профессиональную поддержку
оказала Комиссия Европейской Фармакопеи, принципы которой нашли конкретное воплощение в ГФ PK. И
наконец, издание ГФ PK стало реальным благодаря финансированию данного проекта Министерством здравоохранения
Республики Казахстан.
Выражаю глубокую благодарность всем, кто принимал участие в столь трудном и ответственном деле как
создание ГФ PK. Работа над ГФ PK потребовала от авторского коллектива комплекса профессиональных и
личностных качеств _ строгого мышления, обостренного чувства долга и ответственности, терпения, а главное,
уверенности в достижении намеченного.
Заключаю свое предисловие скромной фразой выдающегося ученого и изобретателя Томаса Эдисоне «Я сделал
все, что мог сделать», которую в равной мере следует отнести к нашему коллективному труду.
Главный редактор Государственной Фармакопеи Республики Казахстан, директор Фармакопейного центра РГП
«Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники
» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, доктор фармацевтических наук, профессор
А.У. ТУЛЕГЕНОВА
I. РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ
ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАКОПЕИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тулегенова Ардак Уринбасаровна
директор Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
заведующий кафедрой химии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
доктор фармацевтических наук, профессор
БЮРО РЕДАКЦИОННОЙ КОЛЛЕГИИ
ПРЕДСЕДАТЕЛЬ
Бердимуратова Гульнара Даумовна
генеральный директор РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского
назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, кандидат медицинских
наук
ОТВЕТСТВЕННЫЙ СЕКРЕТАРЬ
Даулетбакова Фаузия Досмухамедовна
главный специалист РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского
назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, доцент кафедры
фармацевтической и токсикологической химии с курсом фармакогнозии и ботаники Казахского национального
медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, кандидат фармацевтических наук
ЧЛЕНЫ БЮРО
Адекенов Сергазы Мынжасарович
президент АО «Научно-производственный центр Фитохимия» Министерства образования и науки Республики
Казахстан, академик HAH PK, заслуженный деятель науки Республики Казахстан, доктор химических наук,
профессор, лауреат Государственной премии Республики Казахстан
Арыстанова Сарби Нусифовна
заместитель генерального директора РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Баймуканов Сыздык Асылбекович
председатель Комитета фармацевтического контроля Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Дерновой Анатолий Григорьевич
министр здравоохранения Республики Казахстан, доктор медицинских наук
Кузденбаева Раиса Салмагамбетовна
директор Фармакологического центра, эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан, академик HAH PK, доктор м.едицинских наук, профессор, лауреат
Государственной премии Республики Казахстан
Локшин Вячеслав Натанович
президент Ассоциации представительс . в фармацевтических фирм в Республике Казахстан, доктор медицинских
наук, доцент
Муминов Талгат Аширович
ректор Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, академик HAH PK,
академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор
Пак Лариса Юн-Бойевна
заместитель председателя Комитета фармацевтического контроля Министерства здравоохранения Республики
Казахстан
Сабденалиев Даулет Мусралиевич
заместитель генерального директора РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Султанов Серик Егельевич
исполнительный директор Ассоциации «Фарммединдустрия Казахстана»
Сыбанкулова Зурият Нуралимовна
президент Ассоциации поддержки и развития фармацевтической деятельности Республики Казахстан
Шарманов Турегельды Шарманович
директор Регионального центра проблем питания Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
академик HAH PK, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, лауреат Государственной премии
Республики Казахстан
ЧЛЕНЫ РЕДАКЦИОННОЙ КОЛЛЕГИИ
Абдуллин Келесбек Ашинбекович
декан фармацевтического факультета Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова, доктор фармацевтических наук, профессор
Абдыкалыкова Раушан Асагатовна
доцент кафедры органической химии и химии природных соединений Казахского национального университета
имени аль-Фараби, кандидат химических наук
Абилькаева Сауле Асхатовна
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат химических наук, доцент
Абрамова Татьяна Славьевна
главный специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Айдосова Сауле Сагидуллаевна
заведующий кафедрой ботаники Казахского национального университета имени аль-Фараби, доктор
биологических наук, доцент
Акбарова Гульмира Касимовна
главный специалист отдела стандартизации Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения
Республики Казахстан
Аккулов Аскар Гумарович
главный специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат химических наук
Алдабергенов Майлыби Капанович
заведующий кафедрой физической химии и электрохимии Казахского национального университета имени
аль-Фараби, доктор химических наук, профессор
Алимжанова Салтанат Абильевна
начальник отдела стандартизации Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных
средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики
Казахстан
Алпысбаева Салтанат Исабековна
заведующий Испытательной лаборатории ТОО «Алматерра-Мед», эксперт Фармакопейного центра
РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской
техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, кандидат фармацевтических наук
Арыстанов Жалгаскали Мергалиевич
заведующий кафедрой организации и экономики фармации Южно-Казахстанской государственной медицинской
академии, доктор фармацевтических наук, профессор
Арыстанова Та на гуль Акимбаевна
заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии Южно-Казахстанской государственной
медицинской академии, доктор фармацевтических наук, профессор, лауреат Государственной премии Республики
Казахстан
Баимбетова Алмагуль Мажитовна
главный специалист Республиканской иммунологической лаборатории РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения
Республики Казахстан, кандидат биологических наук
Бокенова Загипа Муратовна
специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Батырбаева Айгуль Абдишукировна
старший преподаватель кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова, кандидат химических наук
йейсебеков Марат Киянович
доцент кафедры органической химии и химии природных соединений Казахского национального университета
;.мени аль-Фараби, доктор химических наук
Бейсенбеков Алимхан Сабекович
заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии с курсом фармакогнозии и ботаники
Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, эксперт Фармакопейного
центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и
медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, доктор фармацевтических наук,
профессор
Белоносова Лидия Федоровна
главный специалист отдела стандартизации Формакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения
Республики Казахстан
Бижигитова Бибиткуль Байсултановна
доцент кафедры иммунологии и аллергологии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова, кандидат медицинских наук
Бисенбаев Эдуард Мухамеджанович
главный специалист отдела стандартизации Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан, доктор фармацевтических наук, профессор
Битанова Эльмира Женысхановна
доцент кафедры иммунологии и аллергологии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова, кандидат медицинских наук
Бочкунова Лариса Михайловна
начальник службы контроля качества АО «Химфарм»
Бошкаева Асыл Кенесовна
доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом фармакогнозии и ботаники Казахского
национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, доктор фармацевтических наук
Будукова Гульниса Муратовна
заведующий Испытательной лабораторией ТОО «ГЛОБАЛ-ТЕСТ», эксперт-аудитор
Бухарбаева Ботагоз Альбертовна
специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Веренцова Людмила Георгиевна
доцент кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат химических наук
Винюкова Валентина Евдокимовна
главный специалист Испытательной лаборатории ТОО «Фирма по сертификации продукции Тексеру»
Гафурова Айгуль Акановна
специалист отдела стандартизации Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных
средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики
Казахстан
Гуржина Марина Анатольевна
специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Давыдова Валентина Григорьевна
главный специалист отдела стандартизации Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Дерябин Павел Николаевич
проректор Казахстанского медицинского университета, заведующий кафедрой микробиологии, иммунологии,
эпидемиологии с курсом инфекционных и тропических болезней Казахстанского медицинского университета,
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
доктор медицинских наук, профессор
Джумабаев Бахыт Махатаевич
главный специалист Испытательной лаборатории ТОО «Фирма по сертификации продукции Тексеру»
Дильбарханов Рахимжан Дильбарханович
профессор кафедры организации и экономики фармации с курсом технологии лекарственных форм Казахского
национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, эксперт Фармакопейного центра
РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской
техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, доктор фармацевтических наук
Дуйсенбекова Динара Бектасовна
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат фармацевтических наук
Ержанов Казбек Бекмаганбетович
заведующий кафедрой органической химии и химии природных соединений Казахского национального
университета имени аль-Фараби, доктор химических наук, профессор
Ермаганбетов Мубарак Ермаганбетович
заведующий кафедрой химической технологии Казахского национального технического университета имени
К.И. Сатпаева, доктор химических наук, профессор
Жилкибаев Орал Таникеевич
доцент кафедры органической, физической и коллоидной химии Алматинского технологического университета,
кандидат химических наук
Жубаева Рашида Акмышевна
директор ТОО «ГЛОБАЛ-ТЕСТ», кандидат фармацевтических наук, доцент
Жубанова Ажар Ахметкызы
заведующий кафедрой биологии Казахского национального университета имени аль-Фараби, доктор
биологических наук, профессор
Жубантурлиева Айнагуль Баубековна
ассистент кафедры иммунологии и аллергологии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д- Асфендиярова
Жубатова Индира Амангельдиевна
ведущий специалист Испытательной лаборатории ТОО «Фирма по сертификации продукции Тексеру»
Жумабаева Баян Абильмажиновна
главный специалист Республиканской иммунологической лаборатории РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан, кандидат медицинских наук
Жунусова Гульзада Курметовна
заведующий лабораторией физико-химических методов анализа Испытательного центра РГП «Национальный
центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Жусупова Галия Евентаевна
доцент кафедры органической химии и химии природных соединений Казахского национального университета
имени аль-Фараби, эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных
средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики
Казахстан, доктор химических наук
Ибрагимова Диана Рустамовна
химик Испытательной лаборатории АО «Химфарм»
Илиясова Мария
доцент кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
кандидат химических наук
Кабденова Акмарал Талаповна
заведующий Испытательным, центром РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здраваехра -иЧ P- п . « . .щ Казахстан,
кандидат фармацевтических наук
Казиева Балапан Кабыкеновна
главный специалист Испытательного центра РГП (^Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Калелова Римма Арысбековна
ученый секретарь Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат фармацевтических наук
Каракушикова Айгуль Садвакасовна
доцент кафедры иммунологии и аллергологии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова. кандидат медицинских наук
Каральник Борис Вольфович
главный научный сотрудник Научного центра гигиены и эпидемиологии Министерства здравоохранения
Республики Казахстан, эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных
средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерство здравоохранения Республики
Казахстан, доктор медицинских наук, профессор
Келимханова Сауле Есенкуловна
доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом фармакогнозии и ботаники Казахского
национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, доктор фармацевтических наук
Керейбаева Клара Кабдыгалымовна
заместитель заведующего Испытательной лабораторией ТОО «ГЛОБАЛ-ТЕСТ»
Киргабакова Жанар Нурлыбековна
специалист Испытательной лаборатории ТОО «ГЛОБАЛ-ТЕСТ», кандидат химических наук
Кияшев Даулеткельды Каримович
профессор кафедры организации и экономики фармации с курсом технологии лекарственных форм Казахского
национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, доктор фармацевтических наук
Кожамкулова Жанар Алимбековна
главный специалист Республиканской иммунологической лаборатории РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Коканбаев Азимбек Коканбаевич
профессор кафедры катализа, коллоидной химии и нефтехимии Казахского национального университета имени
аль-Фараби, кандидат химических наук
Кудайбергенова Алия Мамановна
преподаватель кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом фармакогнозии и ботаники
Казохского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, кандидат фармацевтических
наук
Кудайбергенулы Кулакмет
профессор кафедры микробиологии Казахского
С.Д. Асфендиярова, кандидат медицинских наук
национального медицинского университета имени
Ляпунов Владимир Викторович
главный специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат химических наук, доцент
Лях Елена Николаевна
ученый секретарь Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат химических наук
Моденова Патима Сейткалыковна
доцент кафедры химии Казахского национального аграрного университета, кандидат химических наук
Мезенцева Надежда Андреевна
заместитель директора ТОО «ГЛОБАЛ-ТЕСТ», руководитель Органа по подтверждению соответствия, эксперт-
аудитор
Молдакалыкова Анар Жоямергеновна
доцент кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
кандидат химических наук
Молокова Галина Михайловна
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат химических наук
Мотина Эльмира Еркеновна
ведущий специалист Испытательной лаборатории ТОО «ГЛОБАЛТЕСТ»
Мухтаркулова Ляззат Куланбековна
специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Мукшаева Токжан Ильясовна
специалист отдела стандартизации Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных
средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики
Казахстан
Музычкина Раиса Алексеевна
профессор кафедры органической химии и химии природных соединений Казахского национального университета
имени аль-Фараби, эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных
средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики
Казахстан, доктор химических наук
Мурзагалиев Утеп Мурзагалиевич
зедующий кафедрой Международного казахско-турецкого университета, кандидат фармацевтических не заве „ _
-юук, доцент
Мутасова Лилия Александровна
главный специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Мухитдинов Наштай
профессор кафедры ботаники Казахского национального университета имени аль-Фараби, доктор биологических
наук
Мухтаркулова Ляззат Куланбековна
специалист Испыгательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Нахимова Алия Дамировна
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат химических наук
Наден Гульнар Бисембаевна
начальник Испытательной лабораторией ТОО «Фирма по сертификации продукции Тексеру»
Нургалиева Аманкыз Нургалиевна
доцент кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
кандидат химических наук
Омирзакова Кулшат Калибековна
доцент кафедры органической и биологической химии Казахского национального медицинского университета
имени С.Д. Асфендиярова, кандидат биологических ноук
Омарбаева Гульнази Муратовна
специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Ордабаева Сауле Кутумовна
доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии Южно-Казахстанской государственной
медицинской академии, доктор фармацевтических наук
Ормантаева Роза Каскировна •.•>•• -
начальник отдела информационно-аналитического маркетинга РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан, кандидат экономических наук ; >:-'::*''.
Паршина Галина Николаевна
доцент кафедры ботаники Казахского национального университета имени аль-Фараби, кандидат биологических
наук
Полуяненкова Евгения Яковлевна
инженер по качеству первой категории Испытательной лаборатории АО «Химфарм»
Пругло Георгий Юрьевич
доцент кафедры общественного здравоохранения Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова, кандидат медицинских наук
Прядко Ольга Николаевна
начальник отдела стандартизации АО «Химфарм»
Пучкина Лилия Николаевна
преподаватель кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Рахимова Меруерт Алибиевна
координатор программ Фонда Организации объединенных наций в области народонаселения, мастер
общественного здравоохранения
Садвакасова Галия Садвакасовна
ассистент кафедры иммунологии и аллергологии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова
Сатыбалдиева Жаннат Абеновна
заведующий иммунобиологической лабораторией Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан, доктор медицинских наук, профессор
Сламжанова Сауле Бексултановна
доцент кафедры фармакологии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
кандидат медицинских наук
Сулейманов Ерлан Мукаевич
ведущий специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Тауекелова Алия Рамаевна
эксперт Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
кандидат фармацевтических наук
Токтабаева Асель Кыргызбаевна
старший преподаватель кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова, кандидат химических наук
Тугамбаева Озипа Таласбаевна
главный специалист Испытательного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Тусупбаев Несипбай Куандыкович
доцент кафедры катализа, коллоидной химии и нефтехимии Казахского национального университета имени
аль-Фараби, ведущий специалист лаборатории синтеза флотореагентов Института металлургии и обогащения
Министерства образования и науки республики Казахстан, кандидат химических наук
Шабикова Гульжахан Хасеновна
профессор кафедры физической химии и электрохимии Казахского национального университета имени
аль-Фараби, кандидат химических наук
Шин Светлана Николаевна
заместитель заведующего Испытательным центром РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан,
доктор медицинских наук
Шортанбаев Алихан Абжанович
проректор Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова, заведующий
кафедрой иммунологии и аллергологии Казахского национального медицинского университета имени
С.Д. Асфендиярова, доктор медицинских наук, профессор
Чекотаева Кларина Абиевна
доцент кафедры химии Казахского национального медицинского университета имени С.Д. Асфендиярова,
кандидат химических наук
Чуканова Балым Каировна
кандидат филологических наук, доцент
Юй Цун-син Татьяна Ивановна
ассоциированный профессор Казахско-Американского Университета, эксперт Фармакопейного центра
РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской
техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан, кандидат химических наук, доцент
Яловенко Евгений Григорьевич
главный специалист Республиканской базовой лаборатории по экспертизе и стандартизации лекарственных
средств Министерства здравоохранения Республики Казахстан, кандидат химических наук
II. СЕКРЕТАРИАТ РЕДАКЦИОННОЙ КОЛЛЕГИИ
Алтынникова Ольга Дмитриевна
главный специалист Информационно-аналитического маркетингового центра РГП «Национальный центр
экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Байжанов Даурен Серикбаевич
программист Информационно-аналитического маркетингового центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Батырбекова Кулянда Увалхановна
начальник отдела финансово-экономического анализа и бухгалтерского учета РГП «Национальный центр
экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Буженова Нурия Айдашевна
специалист РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и
медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Бурибаев Гани Бахитович
начальник Информационно-аналитического маркетингового центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Гуськова Светлана Ивановна
специалист баз данных Информационно-аналитического маркетингового центра РГП «Национальный центр
экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Жекенова Мадина Дуйсенгалиевна
специалист отдела финансово-экономического анализа и бухгалтерского учета РГП «Национальный центр
экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Ибрагимова Алия Махсутбековна
секретарь Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Кадиркулов Куаныш Кайсарович
программист Информационно-аналитического маркетингового центра РГП «Национальный центр экспертизы
лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства
здравоохранения Республики Казахстан
Казиева Галина Кожабековна
главный специалист нормативно-правового отдела РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств,
изделий медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Мамаева Татьяна Владимировна
начальник нормативно-правового отдела РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Омарова Гульнара Аттиновна
главный специалист РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского
назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
Янышевская Светлана Николаевна
секретарь Фармакопейного центра РГП «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий
медицинского назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
III. ИНОСТРАННЫЕ СПЕЦИАЛИСТЫ,
ПРИНИМАВШИЕ УЧАСТИЕ В СОЗДАНИИ
ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАКОПЕИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
Багирова Валерия Леонидовна
директор Института стандартизации и контроля качества лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы
средств медицинского применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального
развития Российской Федерации, Ученый секретарь Фармакопейного комитета Министерства здравоохранения
и социально:л развития Российской Федерации, доктор фармацевтических наук, профессор, лауреат
Государственной премии Российской Федерации
Баскина Нина Никифоровна
старший лаборант лаборатории контроля качества биотехнологических препаратов Института стандартизации
и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Батурина Ольга Анатольевна
руководитель лаборатории хроматографических методов исследования № 2 Института стандартизации и
контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации,
кандидат фармацевтических наук
Боярская Валентина Александровна
ведущий инженер сектора научно-технической экспертизы ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр»
Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения Министерства
здравоохранения Украины
Георгиевский Виктор Петрович
директор Государственного научного центра лекарственных средств Министерства здравоохранения Украины,
член-корреспондент HAH Украины, заслуженный деятель науки и техники Украины, доктор фармацевтических
наук, профессор
Георгиевский Геннадий Викторович
руководитель группы «Монографии на лекарственные субстанции» ГП «Научно-экспертный фармакопейный
центр» Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения Министерства
здравоохранения Фармакопейного центра Украины, кандидат фармацевтических наук, старший научный
сотрудник
Горюнова Мария Львовна
научный сотрудник лаборатории экспертизы и контроля качества антибиотиков Института стандартизации и
контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Гризодуб Александр Иванович
директор ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр» Государственной службы лекарственных средств и
изделий медицинского назначения Министерства здравоохранения Украины, член Международной ассоциации
официальных химиков-аналитиков, доктор химических наук, профессор
Денисова Ирина Анатольевна
младший научный сотрудник лаборатории хроматографических методов исследования № 1 Института
стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского
применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской
Федерации
Жемерова Екатерина Георгиевна
ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологических методов ГП «Научно-экспертный фармакопейный
центр» Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения Министерства
здравоохранения Украины
Зинченко Александр Анатольевич
заведующий лабораторией фармакопейного анализа ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр»
Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения Министерства
здравоохранения Украины
Ковалева Серафима Васильевна
ведущий научный сотрудник лаборатории контроля качества биотехнологических препаратов Института
стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского
применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской
Федерации, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Кудрявцева Марина Петровна
руководитель лаборатории хроматографических методов исследования № 1 Института стандартизации и
контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации,
кандидат фармацевтических ноук
Кулешова Светлана Ивановна
руководитель лаборатории экспертизы и контроля качества антибиотиков Института стандартизации и контроля
лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Федеральной
службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кандидат
биологических наук
Лавренчук Руслан Александрович
младший научный сотрудник лаборатории контроля радиофармацевтических препаратов и наборов реагентов
для лабораторной диагностики Института стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный
центр экспертизы средств медицинского применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения
и социального развития Российской Федерации
Леонтьев Дмитрий Анатольевич
руководитель группы «Валидация методик, стандартные образцы и метрология» ГП «Научно-экспертный
фармакопейный центр» Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения
Министерства здравоохранения Украины, кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник
Милкина Светлана Евгеньевна
старший научный сотрудник лаборатории экспертизы химико-фармацевтических препаратов Института
стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского
применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской
Федерации
Митькина Лидия Ивановна
руководитель аналитической лаборатории Института стандартизации и контроля качества лекарственных средств
ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Федеральной службы по надзору в сфере
здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор фармацевтических наук
Петрова Елена Владимировна
младший научный сотрудник лаборатории контроля качества витаминов и гормонов Института стандартизации
и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Пиотровская Алла Григорьевна
ученый секретарь ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр» Государственной службы лекарственных
средств и изделий медицинского назначения Министерства здравоохранения Украины
Прохватилова Светлана Степановна
старший научный сотрудник лаборатории контроля качества фитопрепаратов Института стандартизации и
контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации,
кандидат фармацевтических наук
Прохорова Людмила Васильевна
руководитель лаборатории контроля качества фитопрепаратов Института стандартизации и контроля
лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Федеральной
службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кандидат
фармацевтических наук
Процак Светлана Александровна
научный сотрудник лаборатории экспертизы и контроля качества антибиотиков Института стандартизации и
контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Пшеничных Татьяна Ивановна
лаборант лаборатории экспертизы и контроля качества антибиотиков Института стандартизации и контроля
лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Федеральной
службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Рылин Александр Федорович
старший научный сотрудник лаборатории хроматографических методов исследования № 1 Института
стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского
применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской
Федерации
Саматов Рустам Саматович
заведующий научно-техническим отделом ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр» Государственной
службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения Министерства здравоохранения Украины
Середенко Вера Ивановна
старший научный сотрудник лаборатории контроля качества витаминов и гормонов Института стандартизации
и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации,
кандидат химических наук
Симонова Елена Павловна
научный сотрудник лаборатории хроматографических методов исследования № 1 Института стандартизации
и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»
Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Терно Ирина Станиславовна
руководитель отдела по направлению «Общие статьи на методы анализа» ГП «Научно-экспертный
фармакопейный центр» Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения
Министерства здравоохранения Украины, кандидат химических наук
Тихоненко Татьяна Михайловна
старший научный сотрудник группы «Монографии на лекарственные субстанции» ГП «Научно-экспертный
фармакопейный центр» Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения
Министерства здравоохранения Украины
Товмасян Ерануи Карапетовна
руководитель отдела по направлению «Общие статьи на лекарственные формы и фармакотехнологические
тесты» ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр» Государственной службы лекарственных средств и изделий
медицинского назначения Министерства здравоохранения Украины, кандидат биологических наук
Трухачева Людмила Андреевна
младший научный сотрудник лаборатории хроматографических методов исследования № 2 Института
стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского
применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской
Федерации
Чайка Леонид Александрович
ведущий научный сотрудник лаборатории биологических методов ГП «Научно-экспертный фармакопейный
центр» Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения Министерства
здравоохранения Украины, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник
Юдина Ирина Ивановна
заведующий сектором научно-технической экспертизы ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр»
Государственной службы лекарственных средств и изделий медицинского назначения Министерства
здравоохранения Украины
IV. ПРЕДПРИЯТИЯ И ОРГАНИЗАЦИИ,
ПРИНИМАВШИЕ УЧАСТИЕ В СОЗДАНИИ
ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАКОПЕИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
Р Г П «Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского
назначения и медицинской техники» Министерства здравоохранения Республики Казахстан
АО «Химфарм» (Республика Казахстан, г. Шымкент)
ТОО «ГЛОБАЛ-ТЕСТ» (Республика Казахстан, г. Алматы)
ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр» Государственной службы лекарственных средств и
изделий медицинского назначения Министерства здравоохранения Украины
ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Федеральной службы по
надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации
V. ВВЕДЕНИЕ
Создание Государственной Фармакопеи Республики
Казахстан (ГФ PK) осуществляется впервые за всю многовековую
историю становления и развития Казахской
государственности. ГФ PK является символом
суверенного Казахстана наряду с флагом, гербом и
гимном.
В период существования Казахстана в составе России,
а затем СССР государственный контроль за качеством
лекарственных средств проводился благодаря
стандартам и положениям Государственной Русской
фармакопеи, а начиная с 1920 г. - Государственной
Фармакопеи СССР (ГФ СССР). Последние
издания ГФ СССР - X (1969 г.) и Xl (1988 г. и 1990 г.)
сохранили свой законодательный характер в республике
и до сего времени. Однако в новых экономических
условиях развитие фармацевтического рынка Казахстана
имеет свои особенности, которые не могут
быть в полной мере регламентированы прежними
правовыми актами, в том числе советскими изданиями
фармакопеи. Кроме того, расширение номенклатуры
лекарственных средств, повышение требований
к их качеству, значительный прогресс в технике аналитического
эксперимента, произошедшие в последнее
десятилетие, неизбежно привели к устареванию многих
положений ГФ СССР XI. Важным шагом в развитии
государственного контроля за качеством лекарственных
средств в республике явилось признание
международных фармакопеи - Европейской фармакопеи,
Британской фармакопеи, Фармакопеи США и
Немецкой гомеопатической фармакопеи (Приказ Комитета
фармации, фармацевтической и медицинской
промышленности министерства здравоохранения Республики
Казахстан от 11 февраля 2004 года № 21
«О признании международных фармакопеи и классификации
лекарственных средств на территории Республики
Казахстан»),
Впервые необходимость создания собственного национального
стандарта была отмечена Указом Президента
Республики Казахстан, имеющим силу закона,
«О лекарственных средствах» № 2655 от 23 ноября
1995 г. Дальнейшее развитие вопрос создания
ГФ PK нашел в Законе «О лекарственных средствах»
№ 522-11 от 13 января 2004 г.
В соответствии с законом Государственная Фармакопея
Республики Казахстан - это свод государственных
стандартов и положений, нормирующих качество
и безопасность лекарственных средств, зарегистрированных
и разрешенных к применению в установленном
порядке. ГФ PK наделена законодательным
статусом. Она устанавливает тот уровень требований
к безопасности и качеству лекарственных средств,
который государство гарантирует своим гражданам.
Требования ГФ PK являются обязательными для всех
предприятий и организаций Республики Казахстан,
занимающихся производством, изготовлением, реализацией,
хранением, контролем и применением лекарственных
средств.
В 1996 г. Республикой Казахстан взят курс на вступление
во Всемирную Торговую Организацию (ВТО). В
соответствии с этим национальные стандарты качества
лекарственных средств должны быть гармонизированы
с международными стандартами в данной
области, прежде всего с требованиями Европейской
Фармакопеи.
Вступление Республики Казахстан в июне 2006 г. в
статус страны-наблюдателя в Комиссии Европейской
Фармакопеи позволяет республике решать вопросы:
приобретения собственного опыта на основании
европейского опыта работы в области контроля
качества и методов испытания лекарственных
средств;
определения национальных подходов и путей развития
в данной области;
привлечения к научным исследованиям, проводимым
под эгидой Европейской фармакопеи.
В настоящее время регуляторными органами республики
и производителями лекарственных средств достигнуто
ясное понимание неизбежности перехода к
современным требованиям качества, так как только
строгое следование им позволит обеспечить конкурентоспособность
и экспортоориентированность отечественного
производства. Реальным воплощением
тенденций в данной области явились разработка и
утверждение в декабре 2006 г. национальных стандартов
в сфере обращения лекарственных средств,
гармонизированных с международными стандартами
- Надлежащих правил лабораторной (GLP), клинической
(GCP), производственной (GMP), дистрибьюторской
(GDP) и аптечной (GPP) практик. В республике
осуществляются определенные усилия по реконструкции
производства и развитию системы обеспечения
качества фармацевтической продукции в соответствии
с указанными выше правилами.
Европейская Фармакопея регламентирует качество
лекарственных средств, произведенных в соответствии
с требованиями Надлежащей производственной практики
(GMP). В переходный период введение требований
Европейской Фармакопеи в отсутствие реально
выполняемых правил GMP не представляется разумным
решением проблем качества отечественных лекарственных
средств. Кроме того, значительное присутствие
на рынке Казахстана фармацевтической продукции
из республик бывшего СССР и других развивающихся
стран, доступной для большинства населения
по ценовому предложению, ограничивает в полной
мере применение европейских стандартов качества.
г-»- -. .. <.„ -+Onvinrvwi . . . r t u (УЬЛИКИ КАЗАХСТАН
В связи с этим создание национальной фармакопеи,
основанной, на принципах и подходах Европейской
Фармакопеи, но учитывающей особенности развития
фармацевтического рынка республики и отечественного
производства лекарственных средств, является
насущным требованием времени. Эта концепция может
быть реализована путем гармонизации национальных
требований к качеству лекарственных средств
с Европейской фармакопеей, с одной стороны, и
ГФ СССР XI, с другой стороны. Кроме того, подобный
подход согласуется с решениями Межгосударственной
комиссии по стандартизации, регистрации и контролю
качества лекарственных средств, изделий медицинского
назначения и медицинской техники государств-
участников СНГ. Целесообразность такого
подхода была показана ранее Украиной, что нашло
воплощение в издании Государственной Фармакопеи
Украины (ГФУ).
В свете изложенной выше концепции структура ГФ PK
предусматривает двухчастность фармакопейных статей,
как общих, так и частных. Первая часть статей
идентична соответствующей статье Европейской Фармакопеи,
а следующая за ней часть, обозначенная
гербом Республики Казахстан и называемая национальной,
отражает особенности подходов к качеству
лекарственных средств в республике, производство
которых не осуществлялось в соответствии с правилами
GMP. Кроме требований ГФ СССР XI, она включает
альтернативные методики, важные информационные
и методические материалы, необходимые для
пользователей фармакопеи.
Необходимость дифференцирования европейской и
национальной частей в ГФ PK представляется важным
условием соблюдения прав Европейской Фармакопеи
на интеллектуальную собственность. Подобная
концепция создания ГФ PK согласована с Комиссией
Европейской Фармакопеи. Аналогичные принципы положены
в основу конструкции фармакопеи ряда стран
Европейского Сообщества, когда национальная часть
дополняет общеевропейские требования, не противореча
им. В ряде стран национальные требования к
качеству лекарственных средств изданы в виде специального
дополнения.
Важным в понимании является категория соответствия
требованиям ГФ PK. Лекарственные средства, произведенные
согласно Правилам GMP, должны соответствовать
требованиям общей (европейской) части статей
ГФ PK. Требования национальной части относятся
к лекарственным средствам, не произведенным
согласно Правилам GMP. В случаях отсутствия национальной
части требования статей ГФ PK распространяются
на все лекарственные средства независимо
от производства.
ГФ PK предусматривает два тома, из которых первый
том содержит общие фармакопейные статьи, а второй
- частные фармакопейные статьи (монографии)
на лекарственные субстанции, вспомогательные вещества,
лекарственное сырье природного происхождения,
лекарственные формы и иммунобиологические
медицинские препараты.
Так как в основу ГФ PK положены принципы и подходы
Европейской Фармакопеи, то ГФ PK предполагает
изложение материала в редакции, по возможности
близкой Европейской фармакопее. Нумерация разделов
и названия монографий, химические названия
веществ, названия реактивов, единицы измерения
физических величин, формулы расчета и др. практически
идентичны приведенным в Европейской Фармакопее.
Изменение претерпели лишь некоторые буквенные
обозначения физических величин, подставляемые
в формулы расчета, ввиду их традиционности
использования в нормативной документации. В тех же
соображениях расширен круг аббревиатур и сокращений,
применяемых в ГФ PK.
С выходом в свет ГФ PK теряет свою силу ГФ СССР,
что вполне логично в силу гармонизированности с
ней национальной фармакопеи. В частности, выпуск
1 тома ГФ PK приводит к потере законодательного
статуса общих статей ГФ СССР. Это в свою очередь
требует указания ссылок в нормативных документах
Республики Казахстан лишь на ГФ PK. Исключение
может быть сделано в особых случаях, когда необходимый
материал не освещен в национальной фармакопее,
например, при использовании определенных
реактивов, стандартных растворов и др. В этих случаях
текст нормативной документации должен предусматривать
полное их описание или приготовление.
1 . ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
1.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Положения статьи «Общие замечания» распространяются
на все общие статьи, монографии и другие
материалы Государственной Фармакопеи Республики
Казахстан.
В материалах Государственной Фармакопеи Республики
Казахстан сло^о ^Фармакопея» подразумевает
Государственную Фармакопею Республики Казахстан.
Наряду с этим может широко использоваться официальное
сокращение ГФ PK.
Ссылка в материалах Фармакопеи на какую-либо
статью и/или ее раздел означает, что продукт соответствует
требованиям данной статьи. Название
статьи, на которую приводится ссылка, и/или ее номер
обычно выделены курсивом.
Готовое лекарственное средство должно соответствовать
требованиям Фармакопеи на протяжении его
срока хранения. Срок хранения лекарственного препарата,
указанный в стандарте организации, должен
быть согласован с уполномоченным органом на основании
экспериментальных результатов испытаний
стабильности. Любой другой продукт (лекарственная
субстанция, вспомогательное вещество и др.) должен
соответствовать требованиям, Фармакопеи на всем
протяжении периода его использования.
Требования монографии являются обязательными при
отсутствии специальных указаний в статье «Общие замечания
» или в данной монографии. Общие статьи
становятся обязательными, если на них приводится
ссылка в той или иной монографии или другой общей
статье, за исключением случаев, когда ссылка имеет
информационный или рекомендательный характер.
Лекарственные субстанции (активные ингредиенты),
вспомогательные вещества, готовые лекарственные
средства (лекарственные препараты) и другие продукты,
описываемые в монографиях Фармакопеи, предназначены
для использования человеком и в ветеринарии
(при отсутствии других указаний).
Если продукт не соответствует всем без исключения
требованиям монографии Фармакопеи, он не является
продуктом фармакопейного качества. Это не означает,
что для подтверждения соответствия требованиям
Фармакопеи производитель должен перед выпуском
продукта провести все испытания, предусмотренные
монографией. Некоторые данные могут быть
взяты производителем:, например, из валидационных
испытаний в сочетании с результатами постадийного
(межоперационного) контроля процесса производства
данного продукта. Такой подход, если уполномоченный
орган считает его обоснованным, не противоречит
необходимости соответствия требованиям Фармакопеи.
Испытания и методики количественного определения,
приведенные в Фармакопее, являются официальными
методиками, однако по согласованию с уполномоченным
органом могут использоваться и другие (альтернативные)
методики при условии, если они дают результаты,
соответствующие фармакопейным ме-
тодикам. В случае сомнений или разногласий решающей
является фармакопейная методика.
Лекарственные субстанции, вспомогательные вещества
и другие продукты, на которые распространяются требования
Фармакопеи, могут использоваться в разных
целях (например, для получения парентеральных лекарственных
средств или таблетированных лекарственных
форм и т.п.). При отсутствии других указаний требования
монографии распространяются на продукт
независимо от целей его применения. В ряде случаев,
например для вспомогательных веществ, монография
может быть дополнена перечнем характеристик, наиболее
важных для использования данного вещества,
с информационной или рекомендательной целью. В
этих же целях могут быть также приведены методики
контроля одной или нескольких таких характеристик.
Общая статья на ту или иную лекарственную форму
распространяется на все лекарственные средства, изготовленные
в виде данной лекарственной формы. Для
конкретного лекарственного средства требования соответствующей
общей статьи необязательно являются
исчерпывающими и могут быть дополнены производителем
по согласованию с уполномоченным органом.
Принятая терминология. Термин «компетентный
уполномоченный орган» означает национальный, наднациональный
или международный орган (организацию),
уполномоченный принимать решения по соответствующим
вопросам. Это может быть, например, национальный
фармакопейный орган, лицензирующая инстанция
или официальная контрольная лаборатория.
Словосочетание «при отсутствии других указаний в
частной статье»1'1 означает, что требования общей
статьи должны быть выполнены, если только уполномоченный
орган не внес в эти требования изменения,
что указывается в частной статье.
В ряде общих статей и монографий Фармакопеи при
описании реактива, микроорганизма, методики и т.д.
используется термин «подходящий». Если при этом
критерии их пригодности не сформулированы, то пригодность
конкретных реактивов, методик и т.д., используемых
в стандарте организации, должна быть обоснована
уполномоченному органу.
"Под частной статьей подразумеваете* монография Фармо,опеи „„„ с т а н д о р т о р г о н и з о ц И 1 к с о г л о с о в а н н ы П с уполномочена» ортоном
— —- — - -
1.2. ДРУГИЕ ПОЛОЖЕНИЯ,
РАСПРОСТРАНЯЮЩИЕСЯ
НА ОБЩИЕ СТАТЬИ
И МОНОГРАФИИ
Количество вещества. При описании количественного
определения или испытания с численно заданными
пределами количество анализируемой пробы
указано приблизительно. В действительности оно
может отклоняться в пределах ± 10 % от указанного
количества. Необходимо взять точную навеску анализируемой
пробы (или отмерить ее каким-либо другим
способом) и все вычисления производить для этого
точного количества пробы. Если пределы испытания
заданы не численно, а определяются путем сравнения
со стандартом при тех же условиях, в испытаниях
используют строго указанное количество анализируемой
пробы. Реактивы всегда берут в строго указанных
количествах.
Если значения массы навесок или объемов не используют
для дальнейших расчетов, то точность их взятия
(отмеривания, отвешивания) должна согласовываться
с указанной в статье точностью. Точность взвешивания
должна составлять ± 5 единиц после последней
указанной цифры; например, навеску 0.25 г следует
понимать как лежащую в интервале от 0.245 до
0.255 г. Объемы отмеряют следующим образом. Если
после десятичной точки стоит 0 или число,
заканчивающееся 0 (например, 10.0 мл или 0.50 мл),
требуемый объем отмеряют с помощью пипетки, мерной
колбы или бюретки. В остальных случаях можно
использовать градуированный мерный цилиндр или градуированную
пипетку. Объем жидкости, выраженный
в микролитрах, отмеряют с помощью микропипетки
или микрошприца. Необходимо, однако, отметить, что
. некоторых случаях точность, с которой указывают
количество вещества, не соответствует числу значащих
цифр при указании конкретного численного предела.
Взвешивание и измерение осуществляют в этом случае
с более высокой точностью.
Оборудование и аналитические операции.
Стеклянная мерная посуда должна соответствовать
требованиям Класса А Международного стандарта,
выпущенного Международной организацией по стандартизации
(ISO).
Аналитические операции, при отсутствии других указаний,
осуществляют при температуре от 15 0C до
25 °С.
Сравнительные испытания, при отсутствии других указаний,
проводят с использованием пробирок из бесцветного
прозрачного нейтрального стекла с плоским
основанием и внутренним диаметром 16 мм. Сравнивают
равные объемы жидкостей на белом (или, при
необходимости, на черном) фоне. Испытание проводят
в рассеянном свете.
Если для проведения испытания или количественного
определения требуется использовать растворитель с
растворенным в нем индикатором и при этом не предусмотрен
контрольный опыт, этот растворитель предварительно
нейтрализуют по этому индикатору.
Водяная баня. Под данным понятием, при отсутствии
других указаний, подразумевают баню с кипящей
водой. Допускается использование других способов,
если они гарантированно обеспечивают температуру,
близкую, но не превосходящую 100 0C (или
другую указанную температуру).
Высушивание и прокаливание до постоянной
массы. Результаты двух последовательных взвешиваний
должны отличаться не более, чем на 0.5 мг; интервал
времени между двумя взвешиваниями определяется
свойствами и количеством высушиваемого/прокаливаемого
остатка.
В тех случаях, когда требуется высушивание «в эксикаторе
» или «в вакууме», оно осуществляется в соответствии
с условиями, описанными в 2.2.32. «Потеря в
массе при высушивании».
Реактивы. Надежность результатов, получаемых с
помощью описанных в Фармакопее аналитических
операций, зависит, в частности, от качества используемых
реактивов. Реактивы описаны в общей статье 4.
«Реактивы». Подразумеваемая степень чистоты - не
ниже ч.д.а. (analytical grade). Для некоторых реактивов
описание включает испытания на определение
пригодности.
Растворители. Если для растворов не указан растворитель,
то подразумевают водные растворы. Для
проведения описанных в Фармакопее аналитических
операций и для приготовления реактивов используют
воду, соответствующую требованиям частной статьи
«Вода очищенная». Термин «вода дистиллированная»
означает «вода очищенная», полученная путем дистилляции.
Термин «этанол» без уточнений означает абсолютный
спирт. Термин «96 % спирт» без уточнений означает
этиловый спирт, содержащий примерно 96 объемных
процентов этанола. Другие степени разбавления обозначаются
термином «спирт» с указанием содержания
этанола в объемных процентах.
Способы выражения концентрации. Относительная
доля вещества может быть выражена в виде:
- массовой доли (м/м), т.е. отношением массы вещества
к массе смеси;
- объемной доли (об/об), т.е. отношением объема
вещества к объему смеси.
Относительная доля вещества может быть выражена
в следующих относительных единицах:
- процент (%), т.е. часть на сто;
- миллионная доля или миллионная часть (ррт, млн ),
т.е. часть на миллион.
Массовая доля, выраженная в процентах, определяется
числом грамм вещества в 100 граммах смеси.
Объемная доля, выраженная в процентах, определяется
числом миллилитров вещества в 100 миллилитрах
смеси.
Температура. Помимо указания значения температуры
используют также следующие термины:
ниже Глубокое охлаждение
В холодильнике
В холодном или
прохладном месте
При комнатной
температуре
от
от
от
-15 0C
2 0C до 8 0C
8 0C дс 15 0C
15 0C до 25 0C
1.4. МОНОГРАФИИ
НАЗВАНИЯ
Кроме названий на русском языке, приводится также
латинское название. Это название может использоваться
вместо русского названия, равно как и любой
другой синоним, который признан эквивалентным уполномоченным
органом.
ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ АТОМНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ
МАССЫ
Относительная атомная масса [A) или относительная
молекулярная масса (M) указываются при необходимости
в начале монографии. Относительную массу и
графическую формулу приводят в качестве информационного
материала.
1.3. ОБЩИЕ СТАТЬИ ВВОДНАЯ ЧАСТЬ МОНОГРАФИЙ
Контейнеры. Материалы, используемые для контейнеров,
описаны в общей статье 3. «Контейнеры».
Для материалов, используемых для производства контейнеров,
особенно для полимерных материалов, используют
общие названия, каждое из которых охватывает
ряд материалов, отличающихся как свойствами
основного компонента, так и используемыми добавками.
Испытания и пределы нормирования зависят
от конкретного состава материала и таким образом
применимы только при условии, что материал
соответствует вводной части к его спецификации. По
согласованию с уполномоченным органом могут использоваться
материалы других составов, а также
испытания для них.
Спецификации на контейнеры, включенные в статью
3, разрабатывались для всех контейнеров указанной
категории. Однако, учитывая большое разнообразие
существующих контейнеров и возможность появления
новых контейнеров, публикация спецификации не исключает
возможности использования контейнеров, соответствующих
другой спецификации, если это обосновано
и согласовано с уполномоченным органом.
В статьях Фармакопеи могут быть приведены ссылки
на определения и спецификации контейнеров. В разделах
«Определение», «Производство» общих статей
на лекарственные формы может содержаться требование
по использованию определенного типа контейнера.
В разделе «Хранение» некоторых статей может
указываться тип рекомендуемого контейнера.
В вводной части, следующей после названия монографии,
приводится официальное определение субстанции,
готового лекарственного средства или иного
продукта, являющегося предметом монографии.
Пределы содержания. Пределы содержания, указанные
в монографии, означают пределы, полученные
с использованием метода, приведенного в разделе
«Количественное определение».
Лекарственные средства растительного
происхождения. В монографиях на лекарственные
средства растительного происхождения вводная часть
включает указание на предмет монографии. Это может
быть, например, растительное сырье в необработанном
виде или растительное сырье, измельченное
в порошок. Если монография распространяется
на несколько вариантов, например, на оба из указанных,
то это отмечается в вводной части.
ПРОИЗВОДСТВО
Информация в разделе «Производство» призвана
привлечь внимание к некоторым важным аспектам процесса
производства и необязательно является исчерпывающей.
Содержащиеся в ней инструкции адресованы
производителю. Они могут относиться, например,
к источнику материалов, процессу производства,
его валидации и контролю, постадийному (межоперационному)
контролю, а также испытаниям, которые
производитель должен проводить перед выпуском каждой
серии или выбранных серий продукта. Эти положения
необязательно могут быть подтверждены независимым
аналитиком путем анализа готового продук-
... Уполномоченным органом может быть установлено,
что приведенные в данном разделе инструкции были
выполнены. Такое заключение может быть сделано
на основании проверки полученных от производителя
данных, или при инспектировании производства,
или при испытании соответствующих образцов.
Отсутствие раздела «Производство» не означает, что
аспекты процесса производства, отмеченные выше,
не требуют внимания. Любой описанный в Фармакопее
продукт должен производиться в соответствии с
принципами надлежащей производственной практики
(GMP) и соответствующими международными соглашениями,
а также национальными и наднациональными
законами, распространяющимися на продукты,
предназначенные для человека или в ветеринарии.
В разделе «Производство» в монографии на вакцину
могут быть указаны свойства штамма и тестовые методы
для подтверждения этих свойств. Эти методы приводятся
для информации в качестве примера.
СВОЙСТВА
Информация, приведенная в данном разделе, носит
рекомендательный характер.
Растворимость. Для указания растворимости в данном
подразделе используются описательные термины,
которым в температурном интервале от 1 5 0C
до 25 0C соответствуют значения, указанные в Табл.
1.4-1.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Приводимые в данном разделе испытания не рассчитаны
на полное подтверждение химической структуры
или состава продукта. Они предназначены для
подтверждения с приемлемой степенью достоверности
того, что продукт соответствует информации, приведенной
на этикетке.
В некоторых монографиях имеются подразделы «Первая
идентификация» и «Вторая идентификация». Обычно
проводят первую идентификацию. Если имеется гарантия
того, что данная серия субстанции была ранее
сертифицирована на соответствие всем требованиям
монографии, методики испытаний из второго подраздела
могут использоваться вместо методик испытаний
из первого подраздела.
ИСПЫТАНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Область применения. Данные требования не
рассчитаны на охват всех возможных примесей. В частности,
если примесь не определяется с помощью
описанных испытаний, не следует полагать, что она
допустима. См. также ниже раздел «Примеси».
Расчеты. Если при проведении вычислений требуется
пересчет на сухое вещество или безводное вещество
или указывается какое-либо другое условие, то потерю
в массе при высушивании, содержание воды или
иной показатель определяют с помощью метода, описанного
в монографии.
Пределы. Пределы, указанные в монографии, основаны
на результатах обычной аналитической практики,
когда в них уже учтены погрешности аналитического
эксперимента, допустимый разброс при производстве
и приготовлении, а также ухудшение качества
в процессе хранения в приемлемой степени. При
определении соответствия продукта требованиям мо-
Таблица 1.4-1
Термин Примерное количество растворителя (мл),
необходимое для растворения 1 г вещества
Очень легко растворим до 1
Легко растворим более 1 до 10
Растворим « 10 до 30
Умеренно растворим « 30 до 100
Мало растворим « 100 до 1000
Очень мало растворим « 1000 до 10000
Практически нерастворим « 10000
Частично растворим Термин используется для характеристики смесей, содержащих как
растворимые, так и нерастворимые компоненты
Смешивается с... Термин используется для характеристики жидкостей, смешивающихся с
указанным растворителем во всех соотношениях
нографии к указанным пределам не должны добавляться
никакие дополнительные допуски.
Результат, полученный в испытании, округляют до указанного
в пределе количества значащих цифр (при
отсутствии других указаний). При этом последнюю
цифру увеличивают на единицу, если цифра, отбрасываемая
при округлении, больше или равна пяти.
Если цифра, отбрасываемая при округлении, меньше
пяти, последнюю цифру оставляют неизменной.
Допустимый предел примесей. Примерное допустимое
содержание примеси или суммы примесей
может быть приведено в скобках лишь для информации.
Если для данной примеси не указано использование
стандартного образца, ее содержание может
быть выражено, исходя из номинальной концентрации
вещества, используемого для приготовления указанного
в монографии раствора сравнения (при отсутствии
других указаний).
Лекарственные средства растительного
происхождения. Для лекарственного средства
растительного происхождения сульфатная зола, общая
зола, растворимые в воде посторонние вещества,
растворимые в спирте посторонние вещества,
содержание воды, содержание эфирных масел и содержание
действующих веществ вычисляют в расчете
на лекарственное средство, которое не было специально
высушено (при отсутствии других указаний).
Эквиваленты. Значения эквивалентов приводят с
количеством, значащих цифр, требуемым в данной
монографии.
ХРАНЕНИЕ
Информация и рекомендации, приводимые в разделе
«Хранение», не являются исчерпывающими фармакопейными
требованиями, и уполномоченным органом
могут быть указаны конкретные условия хранения, обязательные
для исполнения.
Описанные в Фармакопее продукты следует хранить
таким образом, чтобы предотвратить их загрязнение
и, по возможности, разложение. Если рекомендуются
особые условия хранения, включая тип контейнера
(см. выше раздел «Контейнеры») и температурные
пределы, эти рекомендации приводятся в монографии.
Ниже разъясняются выражения, используемые в монографиях
в разделе «Хранение».
«Защищать от влаги». Выражение означает, что продукт
должен храниться в воздухонепроницаемом контейнере.
При вскрытии контейнера во влажной атмосфере
следует проявлять осторожность. При необходимости
низкое содержание влаги можно поддерживать
с помощью осушающих веществ при условии,
что их прямой контакт с продуктом будет исключен.
«В защищенном от света месте». Выражение означает
одно из трех условий:
- контейнер должен быть изготовлен из материала, в
достаточной степени поглощающего свет, способный
вызвать фотохимические превращения;
- контейнер должен быть помещен во внешний контейнер,
обеспечивающий такую защиту;
- лекарственное средство должно храниться в месте,
исключающем возможность попадания света.
МАРКИРОВКА
Маркировка является предметом национальных и наднациональных
законодательств, а также международных
соглашений. Таким образом, информация в подразделе
«Маркировка» не претендует на полноту. Она
ориентирована прежде всего на фармакопейные цели,
и обязательными являются только те положения, которые
необходимы для подтверждения соответствия продукта
статье. Вся остальная информация носит рекомендательный
характер. В тех случаях, когда в Фармакопее
употребляется термин «этикетка», соответствующая
информация может быть помещена на контейнере,
на упаковке или во вкладыше.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ
Описываемые в статьях Фармакопеи продукты и реактивы
могут оказаться опасными для здоровья, если
не предпринять необходимые меры. Во всех случаях
следует придерживаться принципов надлежащей лабораторной
практики (GLP), а также соответствующих
правил техники безопасности. В некоторые статьи
включены специальные указания о необходимых
мерах предосторожности. Но отсутствие таких указаний
не следует трактовать как отсутствие всякого риска.
ПРИМЕСИ
В монографии может быть приведен перечень всех
известных и потенциальных примесей, для которых показано,
что они контролируются испытаниями. Этот
перечень может быть разделен на две части: «Конкретно
указываемые примеси» и «Другие обнаруживаемые
примеси». В первую часть включают примеси,
которые ранее уже были квалифицированы уполномоченным
органом., В этот список также включают
примеси, для которых известно, что они могут образовываться
в результате естественного метаболизма.
Во вторую часть списка включают потенциальные примеси,
которые не были обнаружены ни в одном из
образцов лекарственного средства за время разработки
монографии или содержание которых не превышало
0.1 %, но которые могут быть обнаружены с
помощью приведенных испытаний.
ФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
В монографии может также приводиться в качестве
информации и рекомендаций перечень физических характеристик,
которые не относятся к официальным
требованиям, но являются важными при использовании
продукта (см. выше /. /. Общие положения).
СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ, СТАНДАРТНЫЕ
ПРЕПАРАТЫ И СТАНДАРТНЫЕ СПЕКТРЫ
Некоторые монографии предусматривают использование
стандартных образцов, стандартных препаратов
или стандартных спектров. Они разработаны
с учетом их назначения, и их следует использовать
так, как предписывает Фармакопея. В других обстоятельствах
они могут оказаться непригодными.
Стандартные образцы, стандартные препараты и стандартные
спектры являются официальными в случае арбитража.
Рабочие стандартные образцы могут использоваться
для проведения текущих анализов при условии, что
они откалиброваны по Фармакопейным стандартным
образцам (ФСО).
Вся информация, необходимая для правильного использования
стандартного образца или стандартного
препарата, приводится на упаковке, во вкладыше или
в сопроводительной документации. При отсутствии указаний
об условиях высушивания стандарт следует использовать
в виде, в котором он получен. Ни сертификат
анализа, ни какая-либо иная дополнительная
информация не предоставляется. Не указывается также
дата «Годен до ...»: гарантируется стабильность
препарата в момент отправки и возможность его использования
в течение шести месяцев при условии,
что нераскупоренный контейнер хранится в условиях,
указанных в сопроводительной документации. Стабильность
содержимого вскрытого контейнера не гарантируется.
Химические стандартные образцы. Аббревиатура
ФСО означает химические стандартные образцы,
установленные Фармакопеей. Некоторые химические
стандартные вещества используются для
количественного определения антибиотиков микробиологическим
методом. В этом случае их активность
выражается в Международных Единицах (ME) аналогично
биологическим стандартным препаратам и указывается
на упаковке или в сопроводительном документе.
Биологические стандартные препараты.
Большинство упоминаемых в Фармакопее биологических
стандартных препаратов представляют собой
соответствующие Международные стандарты и стандартные
препараты, установленные Всемирной
Организацией Здравоохранения (ВОЗ). Поскольку они,
как правило, доступны в ограниченных количествах,
Фармакопея установила в тех случаях, когда это целесообразно,
свои биологические стандартные препараты
(БСП). Их активность выражена, когда это
возможно, в ME.
Стандартные спектры. Стандартный спектр сопровождается
информацией об условиях приготовления
испытуемого образца и записи спектра.
1.5. СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
СИМВОЛЫ И АББРЕВИАТУРЫ
Аг Относительная атомная масса
d 2 0 Относительная плотность
20
M Единица измерения молярной концентрации,
выраженная в моль/л
Мг Относительная молекулярная масса
. 2 0 Показатель преломления
R( Качественная характеристика вещества, определяемая
отношением
пути, пройденного веществом, к пути, пройденному
фронтом
растворителя, на хроматограмме в тонком
слое сорбента
[а] 2 ° Удельное оптическое вращение
. Длина волны
БСП Биологический стандартный препарат
ЕФЕ Европейская фармакопейная единица
ME Международная единица
P Вещество или раствор, указанные в статье
«Реактивы»
P O Исходные стандартные вещества для установки
титра в титриметрии
ФСО Фармакопейный стандартный образец
КОЛЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
ATCC Американская коллекция типовых культур
American Type Culture Collection 12301
Parklawn DriveRockville, MD 20852, USA
С.I.P. Коллекция Пастеровского института (штаммы
бактерий)
Collection de I'lnstitut Pasteur (strains of
bacteria)
.... Пастеровский институт (штаммы других микроорганизмов)
lnstitut Pasteur (strains of other microorganisms)
Service de Ia Collection Nationale de Culture
de
Microorganismes (C.N.CM.) 25 Rue du
Docteur-Roux F-75015 Paris, France
NCIMB Национальная коллекция промышленных и
морских бактерий
National Collection of Industrial and Marine
Bacteria Ltd
23 St Machar Drive Aberdeen AB2 1 RY, Great
Britain
NCPF Национальная коллекция патогенных грибов
Nationol Collection of Pathogenic Fungi
London School of Hygiene and Tropical
Medicine
NCTC Национальная коллекция типовых культур
National Collection of Type Cultures Central
Public Health Laboratory
Colindale Avenue London NW9 5HT, Great
Britain
NCYC Национальная коллекция дрожжевых культур
National Collection of Yeast Cultures AFCR
Food Research Institute
Colney Lane Norwich NR4 7UA, Great Britain
S.S.I. Государственный институт сывороток
Statens Serum Institute 80 Amager Boulevard,
Copenhagen, Denmark
1.6. ЕДИНИЦЫ МЕЖДУНАРОДНОЙ
СИСТЕМЫ (СИ),
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ФАРМАКОПЕЕ И
ИХ СООТВЕТСТВИЕ ДРУГИМ
ЕДИНИЦАМ
Международная система единиц (CMj — это усовершенствованный
вариант метрической системы единиц,
в котором некоторые традиционные единицы заменены
более рациональными единицами в тех случаях,
когда их легко определить через более простые основные
величины. СИ включает три класса единиц измерения
физических величин:
основные единицы;
производные единицы;
дополнительные единицы.
Основные единицы и их определения приведены в
таблице 1.6.-1. Производные единицы могут быть
выражены через основные единицы, имеют свои названия
и символы. Единицы СИ, используемые в Фармакопее,
приведены в Таблице ).6.-2. Дополнительные
единицы практически не используются в фарма-
копеях.
Наравне с единицами СИ допускается к применению
ряд важных и широко используемых внесистемных
единиц, перечисленных в Таблице 1.6.-3.
Множители и приставки для образования десятичных
кратных и дольных единиц приведены в Таблице
1.6.-4.
Таблица 1.6.-1
Основные единицы СИ
Величина Единица Определение единицы
Наименование Символ Наименование Символ
Длина / метр M Один метр представляет собой длину
пути света в вакууме за 1/299 792 458
часть секунды
Масса m килограмм кг Один килограмм равен массе международного
прототипа килограмма
Время ! секунда с Одна секунда представляет собой
время, равное 9 192 631 770 периодов
излучения, соответствующего переходу
между двумя сверхтонкими уровнями
основного состояния атома цезия-133
Сила
электрического тока
I ампер А Один ампер представляет сбой силу
постоянного тока, который, проходя
в двух строго параллельных проводниках
бесконечной длины и ничтожно малого
поперечного сечения, расположенных в
вакууме на расстоянии 1 метр, вызывает
между этими проводниками силу взаимодействия,
равную 2-10'7 ньютон на
каждый метр длины
Термодинамическая
температура
T кельвин К Один кельвин представляет собой
1/273.16 часть от термодинамической
температуры тройной точки воды
Количество вещества . моль моль Один моль представляет собой количество
вещества, содержащее столько
структурных единиц (электронов, атомов,
молекул, ионов и т.п.), сколько атомов
содержится в 0.012 килограмм углерода-12
Сила света ir кандела кд Одна кандела представляет собой интенсивность
свечения в данном направлении
от источника монохроматического излучения
частотой 540•1O12 герц и мощностью
1/683 ватт на один стерадиан
Таблица 1.6.-2
Единицы СИ, используемые Фармакопеей, и их соответствие другим единицам
Величина Единица Преобразование иных
единиц в единицы СИ
Наименование
Символ
Наименование Символ Выражение
в
основных
единицах
СИ
Выражение
в иных
единицах
СИ
Волновое
число
V единица на
один метр
1/м ."'
Длина
волны
Я микрометр
нанометр
M K M
нм
..'4 м
10"9 м
Площадь A, S кв. метр M 2 M 2
Объем V куб. метр M 3 M 3 1 мл = T см3 = 10'6 м3
Частота V герц Гц С'1
Плотность P килограмм на
куб. метр
кг/м3 кг-м'3 1 г/мл = 1 г/см3 = 103кг-м"3
Скорость V метр в секунду м/с M-C"1
Сила F ньютон H м-кг-с"2 1 дин = 1 г-см-с"2 = 10"5H
1 kp = 9.806 65 H
Давление P паскаль Па м''-кг-c'2
H-M"2 1 дин/см2 =10'' Па =
10-' Н-м"2
1 атм = 101 325 Па =
101.325 кПа
1 бар = 105 Па = 0.1 ...
1 мм.рт.ст. = 133.322387 Па
1 Торр = 133.322 368 Па
1 psi = 6 894 757 кПа
Динамическая
вязкость
. паскаль-секунда Па-с м"'-кг-с"' Н-с-м-2 1 . - 10-' Па-с - 10-' Н-с-м2
1сП = 1 мПас
Кинематическая
вязкость
V квадратный
метр
на секунду
м2/с м2-с"> Па-с-м3-кг'
Н-м-с-кг'1
1 C T = 1 см2-с"' = 10"4м2-с"'
Энергия W джоуль Дж . .0
м--кг-с Н-м 1 эрг = 1CM2 T - C " 2=
1 динсм = 10"' Дж
1 кал = 4.1868 Дж
Поток
электромагнитного
излучения
P ватт Вт м"2-кг-с"3 Н-с-м"1
Дж-с'
1 эрг/с = 1 динсмс"' =
1 0 7 B T - 1 0 7 H M - C " ' =
10 7 Дж-с-1
Поглощенная
доза
ионизирующего
излучения
L) грей Гр м2-с' Дж-кг"1 1 рад - 10 2 Гр
Электрический
потенциал,
электродвижущая
сила
U вольт В м2-кг-с'3-А"' B T A - '
Электрическое
сопротивление
R O M Ом м2-кг-с '3A'2 B-A-'
Количество
электричества
Q кулон Кл Ac
Радиоактивность
вещества
А беккерель Бк с1 1 Ku = 37109 Бк =
37•1O9 с/'
Молярная
концентрация
С моль на кубический
метр
моль/м3 моль-м'3 1 моль/л = 1 M =
1 моль/дм3 = 103 моль-м-3
Массовая
концентрация
P килограмм на
кубический
метр
кг/м3
K P M - 3 1 г/л = 1 г/дм3 = 1 кг-м'3
Таблица 1.6.-3
Единицы, используемые наряду с единицами СИ
Величина Единица Значение в единицах СИ
Время
минута мин 1 мин = 60 с час ч 1 ч = 60 мин = 3600 с
сутки сут 1 сут - 24 ч = 86 400 с
Угол на плоскости градус о 1 = (./180) рад
Объем литр л 1 л = 1 дм3 - .."3
. 3 ™ ' "
Масса тонна T 1 . = 103 кг
Частота вращения оборот в минуту об/мин 1 об/мин = (1/60) с'
Таблица 1.6.-4
Множители и приставки для образования десятичных кратных и дольных единиц
Множитель Приставка Обозначение Множитель Приставка Обозначение
ю'8 экза E .."' деци д
io, s пета P .."2 санти с
ю'2 тера T ..3
М И Л Л И M
ю9 гига Г микро мк
ю6 мега M ю9 нано H
ю3 кило к ю-'2 пико .
ю2 гекто г ю-'5 фемто .
10' дека да ю-,в а тто а
ПРИМЕЧАНИЯ
1. В Фармакопее для обозначения температуры по
Цельсию используется символ t. Температура по Цельсию
определяется согласно уравнению t = T - T0,
T0 = 273.15 К. Температура по Цельсию выражается
в градусах Цельсия (символ °С). Один градус Цельсия
равен одному кельвину.
2. Практические выражения для концентраций, используемых
в Фармакопее, определены в Общих замечаниях.
3. Радиан представляет собой плоский угол, вырезающий
на окружности дугу, равную по длине радиусу.
4. В Фармакопее условия центрифугирования определяются
центробежным ускорением по отношению к
ускорению свободного падения (д), которое принимается
равным 9.806 65 м-с"2.
5. В Фармакопее некоторые величины используются
без размерности, например, относительная плотность
(2.2.5); оптическая плотность (2.2.25); удельный показатель
поглощения (2.2.25)и показатель преломления
(2.2.6); равно, как и величины, выраженные в иных
единицах, например, удельный показатель оптического
вращения (2.2.7).
6. Микрокатал определяется как энзиматическая активность,
которая при указанных условиях приводит к
превращению (нопример, к гидролизу) 1 микромоль
субстрата в одну секунду.
1.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Общие статьи на методы анализа, лекарственные
формы и фармакотехнологические испытания (ОФС),
а также частные статьи на лекарственные средства
(монографии), входящие в ГФ PK, делятся на две части:
часть, гармонизированная с Европейской
Фармакопеей (ЕФ);
национальная часть, гармонизированная с ГФ
СССР и законодательством. Республики Казахстан.
Часть статьи, гармонизированная с ЕФ, представляет
собой адаптированный перевод соответствующего материала
ЕФ. Национальная часть статьи включает
особенности испытаний, детализацию их условий, имеющую
важное значение, дополнительные испытания,
информационные и иные материалы. В некоторых случаях
национальная часть содержит требования к качеству
лекарственных средств, производство которых
не осуществляется в соответствии с требованиями
надлежащей производственной практики (GMP), установленными
в Европейском Союзе. Национальная
часть следует после герба Республики Казахстан. В
ряде статей национальная часть может отсутствовать.
Нумерация ОФС ГФ PK совпадает с нумерацией соответствующих
статей ЕФ. ОФС, не описанные в ЕФ,
вынесены в конец соответствующего раздела. ОФС
на субстанции и лекарственные формы расположены
в алфавитном порядке.
Принятая терминология. Термин «уполномоченный
орган в области здравоохранения» (сокращенно
- уполномоченный орган) означает центральный исполнительный
орган, осуществляющий государственное
регулирование в области охраны здоровья граждан,
медицинской и фармацевтической науки, медицинского
и фармацевтического образования, санитарно-
эпидемиологического благополучия населения,
обращения лекарственных средств, контроля за качеством
медицинских услуг. В Республике Казахстан уполномоченным
органом в области здравоохранения является
Министерство здравоохранения Республики
Казахстан.
Термин «государственный орган в сфере обращения
лекарственных средств» (сокращенно - государственный
орган) означает государственный орган, осуществляющий
в пределах компетенции уполномоченного
органа в области здравоохранения исполнительные,
контрольные и надзорные функции, а также руководство
в сфере обращения лекарственных средств.
В Республике Казахстан государственным органом в
сфере обращения лекарственных средств является
Комитет фармации Министерства здравоохранения
Республики Казахстан.
1.3. ДРУГИЕ ПОЛОЖЕНИЯ,
РАСПРОСТРАНЯЮЩИЕСЯ
НА ОБЩИЕ И ЧАСТНЫЕ СТАТЬИ
Относительная атомная масса и относительная
молекулярная масса. В ГФ PK значения относительной
атомной массы и относительной молекулярной
массы указываются без единиц измерения
(атомная единица массы, а.е.м.).
Время. Не допускается применение единиц времени
с приставками.
Способы выражения концентрации. Количества
жидких веществ и растворов, применяемых при приготовлении
смесей, могут указываться в виде соотношения
по объему.
Температура. Допускается использование следующих
терминов:
1.5. СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
Теплый от 40 0C до 50 0C
Горячий от 80 СС до 90 0C
Температура «водяной бани» от 98 0C до 100 0C
Температура «ледяной бани» 0 °С
1.4. МОНОГРАФИИ
Требования национальной части не являются обязательными
для продуктов, имеющих сертификат соответствия
ЕФ.
ПРОИЗВОДСТВО
Описанные в ГФ PK продукты должны производиться
в соответствии с требованиями, принятыми в PK.
СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ, СТАНДАРТНЫЕ
ПРЕПАРАТЫ И СТАНДАРТНЫЕ СПЕКТРЫ
В качестве фармакопейных стандартных образцов и
стандартных спектров в ГФ PK применяются стандартные
образцы и стандартные спектры, регламентируемые
фармакопеями, признанными действующими в
PK.
КОЛЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Коллекция штаммов микроорганизмов
РГП «Казахский научный центр карантинных и зоо-
нозных инфекций им. М. Айкимбаева»
050074 Алматы, ул. Капальская 14
Коллекция штаммов Российского музея патогенных
бактерий
Государственный институт стандартизации и контроля
медицинских биологических препаратов
им. Л.А. Тарасевича
121002 Москва, Сивцев-Вражек 41
СИМВОЛЫ ФИЗИЧЕСКИХ ВЕЛИЧИН
Наряду с принятыми в ЕФ в Республике Казахстан
могут быть использованы символы и аббревиатуры,
традиционно применявшиеся в нормативных документах:
D
Е , %
\см
рН
w
X
Средняя масса единицы лекарственной
формы
Оптическая плотность
Удельный показатель поглощения
Водородный показатель
Время удерживания
Потеря в массе при высушивании
Содержание определяемого компонента
Молярный показатель поглощения
АББРЕВИАТУРЫ
ВЭЖХ
гх
гжх
ИЮПАК
ОФС
СИ
СО ГФ PK
тех
ЭЕ
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Газовая хроматография
Газожидкостная хроматография
Международный союз теоретической
и прикладной химии
Общая фармакопейная статья
Международная система единиц
Стандартный образец Государственной
Фармакопеи Республики Казахстан
Тонкослойная хроматография
Эндотоксиновая единица
Украинская коллекция микроорганизмов
Институт микробиологии им. Д.К. Заболотного HAH
Украины
01000 Киев, ул. Заболотного 154
Пористость
фильтра
Максимальный
диаметр пор в
микрометрах
Германия Франция Великобритания
W
- менее 1.0 - - - ПОР1.0
1.6 менее 1.6 5f - - ПОР1.6
- 1 - 2.5 5 - 5
- 1.6-3 - - - ПОРЗ.О
4 1 . 6 -4 - - -
- 4 - 6 - 5 -
- 3 - 10 - - - ПОРЮ
10 4 - 1 0 4f - 4
16 10 - 16 4 4 - ПОР16
40 16 -40 3 3 3 ПОР40
- 40 - 50 - - 2
100 40 - 100 2 2 - ПОР100
- 100 - 120 - - 1
160 100 - 160 1 1 - ПОР160
- 150 - 200 0 0 -
250 160 - 250 - - - ПОР250
- 200 - 500 - 00 -
500' 250 - 500 - - - ПОР500
''Данные пределы являются приблизительными.
ь Европейская фармакопея приняла систему, предложенную Международной Организацией по Стандартизации (ISO).
2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА
2.1. ОБОРУДОВАНИЕ
2.1.2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ТАБЛИЦА ПОРИСТОСТИ СТЕКЛЯННЫХ ФИЛЬТРОВ0 1.
следующее применение фильтров:
Бактериологическое фильтрование.
Ультратонкая фильтрация, отделение микроорганизмов большого диаметра.
Аналитическая фильтрация, очень тонкая фильтрация ртути, очень тонкое диспергирование газов.
Тонкая фильтрация, фильтрация ртути, тонкое диспергирование газов.
Грубая фильтрация, диспергирование и промывка газов, использование в качестве подложки для
других фильтрующих материалов.
Очень грубая фильтрация частиц, диспергирование и промывка газов.
Таблица 2.1.2.-1
2.1.4. СИТА
Сита с квадратными отверстиями изготавливают из
соответствующих материалов. Для неаналитических
процедур также могут быть использованы сита с круглыми
отверстиями, диаметр которых в 1.25 раза превышает
размер стороны квадратного отверстия сита
соответствующего номера. Не должно быть взаимодействия
между материалом, из которого изготовлено
сито, и веществом, которое просеивают. Измель-
ченность указывают в частной статье, используя номер
сита, соответствующий номинальному размеру
стороны отверстия в микрометрах, который приводится
в скобках после названия вещества.
Максимальный допуск1'1 для размера отверстия (+ X)
вычисляют по формуле:
.= + 4 . (W025),
3
где
W - номинальный размер отверстия.
При этом не должно быть отверстий, размер которых
превышает номинальный размер более, чем на величину
X.
Допуск для среднего значения размера отверстия
(± Y) вычисляют по формуле:
У/ 098
27
+ 1.6
При этом средний размер отверстия не должен отклоняться
от номинального размера более чем на
величину (± .).
Промежуточный допуск /+ Z) вычисляют по формуле:
X + Y
Z =
2
При этом не более чем 6 % общего числа отверстий
могут иметь размеры между «номинальный + X» и «номинальный
+ .».
Диаметр d проволоки, применяемой для плетения
металлической проволочной ткани, вставленной в
раму, представлен в Табл. 2.1.4.-1. Диаметр проволоки
должен находиться в пределах от d до d у Эти
пределы соответствуют допускам (± 15 %) от рекомендованного
номинального диаметра. Диаметр проволоки
в ситах должен быть одинаковым по всему ситу.
Таблица 2.1.4.-1
Номер сита
(номинальный
размер отверстия,
мкм)
Допуск для отверстия, мкм Диаметр проволоки, мкм
Максимальный
допуск для
отверстия
Допуск Д ЛЯ
среднего
значения
размера
отверстия
Промежуточный
допуск
Рекомендованный
номинальный
диаметр
Допустимый
предел
+ X ± Y + Z d d d
11200 770 350 560 2500 2900
ffllH
2100
8000 600 250 430 2000 2300 1700
5600 470 180 320 1600 1900 1300
4000 370 130 250 1400 1700 1200
2800 290 90 190 1120 1300 950
2000 230 70 150 900 1040 770
1400 180 50 ПО 710 820 600
1000 140 30 90 560 640 480
710 112 25 69 450 520 380
500 89 18 54 315 360 270
355 72 13 43 224 260 190
250 58 9.9 34 160 190 130
180 47 7.6 27 125 150 106
125 38 5.8 22 90 104 77
90 32 4.6 18 63 72 54
63 26 3.7 15 45 52 38
45 22 3.1 13 32 37 27
38 I — 30 35 24
/ , ; См. Международный Стандарт ISO 3310/1(1975).
2.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЗРАЧНОСТИ
И СТЕПЕНИ ОПАЛЕСЦЕНЦИИ
ЖИДКОСТЕЙ
ВИЗУАЛЬНЫЙ МЕТОД
Для определения прозрачности и степени опалесцен-
ции жидкостей используют одинаковые пробирки из
бесцветного прозрачного нейтрального стекла с плоским
дном, имеющие внутренний диаметр от 15 мм до
25 мм. Сопоставляют испытуемую жидкость с толщиной
слоя 40 мм со свежеприготовленной суспензией
сравнения с той же толщиной слоя. Сравнение жидкостей
проводят в рассеянном дневном свете через
5 мин после приготовления суспензии сравнения, просматривая
образцы вдоль вертикальной оси пробирок
на чернод'. фоне. Рассеяние света должно быть
таким, чтобы суспензия сравнения I легко отличалась
от воды Р. а суспензия сравнения Il легко отличалась
от суспензии сравнения I.
Испытуемую жидкость считают прозрачной, если она
выдерживает сравнение с водой P или растворителем,
используемым! для приготовления испытуемой
жидкости, при просмотре в описанных выше условиях
или ее опалесценция не превышает опалесценцию
суспензии сравнения I.
РЕАКТИВЫ
Раствор гидразина сульфата. 1.0 г гидразина сульфата
P растворяют в воде P и доводят объем раствора
водой Pдо 100.0 мл. Раствор выдерживают в течение
4-6 ч.
Раствор гексаметилентетрамина 2.5 г гексаме-
тилентетрамина /'растворяют в 25.0 мл воды PB колбе
вместимостью 100 мл со стеклянной притертой
пробкой.
Первичная опалесцирующая суспензия (суспензия
формазина). 25.0 мл раствора гидразина сульфата
прибавляют к приготовленному раствору гексаметилентетрамина,
перемешивают и оставляют на 24 ч.
Суспензия стабильна в течение 2 мес при хранении в
стеклянной посуде, не имеющей дефектов поверхности.
Суспензия не должна прилипать к стеклу, перед
использованием ее необходимо тщательно взбалтывать.
Стандарт опалесценции. 15.0 мл первичной опа-
лесцирующей суспензии доводят водой P до объемо
1000.0 мл. Срок хранения стандарта опалесценции
24 ...
Суспензии сравнения. Приготовление суспензии
сравнения проводят в соответствии с Табл. 2.2.1-1.
Стандарт опалесценции и воду P смешивают и непосредственно
перед использованием встряхивают.
Таблица 2.2.1.-1
Суспензии сравнения
I Il III IV
Стандарт
опалесценции
5.0
мл
10.0
мл
30.0
мл
50.0
мл
Вода P 95.0
мл
90.0
мл
70.0
мл
50.0
мл
Стандарт мутности. Суспе нзия формазина, приготовленная
путем смешивания равных объемов растворов
гидразина сульфата и гексаметилентетрамина,
применяется в качестве первичного стандарта с характеристичным
значением мутности 4000 НЕМ (не-
фелометрических единиц мутности). Суспензии сравнения
I, I I , III и IV должны иметь характеристичные
значения мутности 3 НЕМ, 6 НЕМ, 18 НЕМ и 30 НЕМ
соответственно. Допускается применение имеющихся
в продаже стабильных суспензий формазина для приготовления
устойчивых разбавленных стандартов мутности
после их приведения к стандарту в соответствии
с указаниями в частной статье.
По физическим свойствам формазин является идеальным
стандартом мутности, приготовление которого
легко воспроизводится из контролируемых исходных
веществ.
Формазин представляет собой полимер, состоящий
из цепей различной длины, которые вследствие гибкости
принимают различные конформации и образуют
частицы различных форм и размеров. Ввиду многообразия
частиц суспензия формазина аналитически сопоставима
с возможными формами и размерами частиц
в испытуемых образцах. Благодаря воспроизводимости,
характеристикам рассеяния и чувствительности
суспензию формазина используют в качестве
светорассеивающего стандарта для калибровки прибора.
ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
ВВЕДЕНИЕ
Степень опалесценции определяют также по оптической
плотности опалесцирующих растворов и суспензий
с помощью инструментальных методов путем измерения
поглощенного (турбидиметрия) или рассеянного
(нефелометрия) света. Для измерения мутности
окрашенных образцов используют Ratio-вариант, объединяющий
принципы нефелометрии и турбидиметрии.
Турбидиметрию и нефелометрию применяют для измерения
слабо рассеивающих суспензий с использованием
суспензий сравнения, приготовленных в одинаковых
условиях. Для количественного определения
необходимо построение калибровочных графиков ввиду
полуэмпирического характера соотношения между
оптическими свойствами суспензии и концентрацией
дисперсной фазы.
Использование соотношения сигналов в Ratio-турби-
диметрии или нефелометрии обусловлено тем, что
окраска жидкости вызывает отрицательную интерференцию,
ослабляющую интенсивность как падающего,
так и рассеянного света. Вследствие этого наблюдается
существенное понижение степени мутности, что
ограничивает использование традиционных нефелометров
даже для умеренно окрашенных растворов.
Применение инструментальных методов является более
предпочтительным, так как не зависит от остроты
зрения исследователя. Полученные числовые данные
важны для контроля качества и управления процессом,
особенно при испытаниях стабильности. Например,
предварительные числовые значения при испытании
стабильности позволяют прогнозировать срок
хранения лекарственных средств.
НЕФЕЛОМЕТРИЯ
При рассмотрении суспензии под прямым углом к
направлению падающего света наблюдается рассеяние,
обусловленное отражением света от частиц суспензии
(эффект Тиндаля). Определенная часть падающего
света пропускается, другая часть поглощается,
а оставшаяся - рассеивается взвешенными частицами
мутной жидкости. Если измерение проведено под
углом 90 0 к падающему лучу, то светорассеяние может
быть использовано для определения концентрации
частиц при условии постоянства их числа и размеров.
Испытуемая жидкость и суспензия сравнения
должны быть приготовлены в одинаковых условиях, при
этом степень мутности суспензии сравнения должна
быть постоянной. Эффект Тиндаля зависит как от числа
частиц, так и от их размера. Нефелометрические
измерения наиболее достоверны в области низкой
мутности, в которой соблюдается линейное соотношение
между величиной рассеяния света и относительным
сигналом детектора. При увеличении степени
мутности жидкости падающий свет претерпевает
множественное рассеяние, в результате которого интенсивность
проходящего света становится ниже интенсивности
рассеянного, что приводит к завышению
показаний прибора. Измерения достоверны в интервале
значений мутности 1750 _ 2000 НЕМ. Линейная
зависимость должна быть установлена построением
калибровочной кривой с использованием не менее
четырех концентраций.
ТУРБИДИМЕТРИЯ
Мутность как оптическое свойство представляет собой
взаимодействие света и взвешенных в жидкости
частиц. Оно вызывает рассеяние и поглощение света
в большей степени, чем пропускание света через образец.
Количество твердых частиц в суспензии может
быть определено измерением прошедшего света. Линейное
соотношение между мутностью и концентрацией
соблюдается в очень разбавленных суспензиях,
содержащих однородные мелкие частицы одинакового
размера. Линейная зависимость мутности от концентрации
должна быть установлена построением калибровочной
кривой с использованием не менее четырех
концентраций.
RATIO-ТУРБИДИМЕТРИЯ
В Rafio-турбидиметрии определяют отношение интен-
сивностей прошедшего и рассеянного света, направленных
под углом 90 °, компенсируя интенсивность
света, снижаемого окраской образца. Влияние окраски
образца может быть также исключено путем использования
в качестве источника света инфракрасных
светодиодов (ИК СД) с длиной волны 860 нм. Фотодиодные
детекторы прибора принимают и измеряют
рассеянный свет под углом 90 0 по отношению к образцу,
а также суммарное значение интенсивностей
отраженного и прошедшего света. Результаты измерений
выражают в НЕМ и получают путем расчета
отношения интенсивности рассеянного света под углом
90 0 к сумме значений интенсивности отраженного
и прошедшего света. В Ratio-турбидиметрии влияние
рассеянного света вследствие компенсации становится
незначительным. Нефелометры используют для
измерения степени опалесценции бесцветных растворов.
Линейную зависимость опалесценции от концентрации
устанавливают методом Ratio-турбидиметрии на
суспензиях сравнения I - IV.
Для калибровки прибора могут быть использованы
суспензии сравнения I - IV .
Таблица 2.2.1.-2
Суспензии формазина Значения
опалесценции (НЕМ)
Суспензия сравнения I 3
Суспензия сравнения Il 6
Суспензия сравнения III 18
Суспензия сравнения IV 30
Стандарт опалесценции 60
Первичная опалесцирую- 4000
щая суспензия
ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СТЕПЕНИ ОПАЛЕСЦЕНЦИИ
В монографиях степень мутности определяют визуальным
методом, используя суспензии сравнения. Допускается
применение инструментальных методов. При
этом характеристики приборов должны соответствовать
указанным в монографии. Прибор должен быть
откалиброван с помощью суспензий сравнения I - IV
и воды Р, или используемого растворителя.
Приборы. В Raiio-1>рбидиметрах и нефелометрах в
качестве источника света используют вольфрамовую
лампу с нитью накала 2700 К и максимальной чувствительностью
при длине волны 550 нм или ИК СД с
длиной волны 860 нм и шириной спектральной полосы
60 нм. Допускается использование других источников
света. В качестве детекторов обычно используют
кремниевые фотодиоды и фотоэлектронные умножители.
Детектор, определяющий рассеяние света под углом
90 ° ± 2.5 ° к направлению падающего луча, является
основным. Другие детекторы служат для фиксирования
проходящего света, обратного и прямого рассеяния.
Используемые приборы должны быть откалибро-
ваны с помощью стандартов мутности и определять
мутность автоматически. Результаты измерения, выраженные
в НЕМ, считывают непосредственно с прибора
и сравнивают с требованиями спецификаций в
частных статьях.
Характеристики приборов:
- Единицы измерения: НЕМ.
НЕМ основана на мутности первичного стандарта
сравнения формазина. Допускается применение ЕМФ
(единицы мутности по формазину) или НЕФ (нефело-
метрические единицы по формазину), эквивалентные
НЕМ в области низкой мутности (до 40 НЕМ).
Приведенные единицы используют во всех инструментальных
методах (нефелометрии, турбидиметрии и
Ratio-турбидиметрии).
- Область измерения: 0.01-1 100 НЕМ.
- Разрешение: 0.01 НЕМ в диапазоне 0-10 НЕМ,
0.1 НЕМ в диапазоне 10-100 НЕМ и 1 НЕМ для
диапазона более 100 НЕМ. Прибор калибруют и контролируют
по СО Г. PK формазина.
- Правильность: 0-10 НЕМ: ± 0.01 НЕМ, 0-1000 НЕМ:
± 5 %.
- Сходимость: 0-10 НЕМ: ± 0.01 НЕМ, 10-1000 НЕМ:
± 2 %.
- Калибровка: прибор калибруют, используя четыре
суспензии сравнения формазина в исследуемой области.
Допускается применение описанных в данной
главе суспензий сравнения или подходящих стандартов
сравнения, откалиброванных относительно первичных
суспензий сравнения.
- Постороннее светорассеяние: исходит не от образца
и, достигая детектор, является источником существенной
погрешности при низких значениях мутности.
Значение постороннего светорассеяния составляет
менее 0.15 НЕМ для диапазона 0-10 НЕМ, менее
0.5 НЕМ для диапазона 10-1000 НЕМ.
Допускается использование других аттестованных и
пригодных для указанных целей приборов, отличающихся
по вышеперечисленным характеристикам. Методики
испытаний лекарственных средств должны быть
валидированы. При выборе приборов и методик следует
учитывать их совместимость со свойствами испытуемой
жидкости.
2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ
ОКРАСКИ ЖИДКОСТЕЙ
Определение степени окраски жидкостей в ряду коричневый
- желтый - красный проводят визуально
путем сравнения с соответствующими растворами
сравнения одним из двух описанных ниже методов,
указанным в частной статье.
Раствор считают бесцветным, если он выдерживает
сравнение с водой P или растворителем, или окрашен
не более интенсивно, чем раствор сравнения B9.
МЕТОД I
2.0 мл испытуемой жидкости сравнивают с 2.0 мл
воды P или растворителя, или раствора сравнения
(см. Таблицы растворов сравнения), указанного в частной
статье, используя одинаковые пробирки из бесцветного
прозрачного нейтрального стекла с наружным
диаметром 12 мм. Сравнение окраски проводят
в рассеянном дневном свете, просматривая образцы
горизонтально (перпендикулярно оси пробирок) на
белом фоне.
МЕТОД Il
40 мм слой испытуемой жидкости сравнивают с 40 мм
слоем воды P или растворителя, или раствора сравнения
(см. Таблицы растворов сравнения), указанного
в частной статье, используя одинаковые пробирки из
бесцветного прозрачного нейтрального стекла с плоским
дном, имеющие внутренний диаметр от 15 мм до
25 мм. Сравнение окраски проводят в рассеянном
дневном свете, просматривая образцы вдоль вертикальной
оси пробирок на белом фоне.
РЕАКТИВЫ
Исходные растворы
Желтым раствор. 46 г железа(Ш) хлорида P помещают
в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в
900 мл смеси: кислота хлороводородная P - вода P
(25:975), доводят объем раствора этой же смесью до
метки и перемешивают. Определяют концентрацию
полученного раствора и разбавляют раствор этой же
смесью таким образом, чтобы содержание Fe0l3,6H2O
в 1 мл составляло 45.0 мг.
Раствор хранят в защищенном от света месте.
Определение концентрации. 10.0 мл полученного
раствора помещают в коническую колбу с притертой
стеклянной пробкой вместимостью 250 мл, прибавляют
15 мл воды Р, 5 мл кислоты хлороводородной
P и 4 г калия йодида P1 колбу закрывают и оставляют
на 15 мин в темном месте. Прибавляют 100 мл
воды P и выделившийся йод титруют 0.1 M раствором
натрия тиосульфата, прибавляя в конце титрования
в качестве индикатора 0.5 мл раствора крахмала
Р.
1 мл 0.1 M раствора натрия тиосульфата соответствует
27.03 мг FeCI3,6H20.
Красный раствор. 60 г кобальта хлорида P помещают
в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в
900 мл смеси: кислота хлороводородная P- вода P
(25:975), доводят объем раствора этой же смесью до
метки и перемешивают. Определяют концентрацию
полученного раствора и разбавляют раствор этой же
смесью таким образом, чтобы содержание СоС12,6Н20
в 1 мл составляло 59.5 мг.
Определение концентрации. 5.0 мл полученного раствора
помещают в коническую колбу вместимостью
250 мл с притертой стеклянной пробкой, прибавляют
5 мл раствора пероксида водорода разбавленного
P M 10 М Л раствора 300 г/л натрия гидроксидо Р,
осторожно кипятят 10 мин, охлаждают и прибавляют
60 мл кислоты серной разбавленной P и 2 . калия
йодида Р. Колбу закрывают и осторожно встряхивают
до полного растворения осадка. Выделившийся йод
титруют 0.1 M раствором натрия тиосульфата, прибавляют
в конце титрования в качестве индикатора
0.5 мл раствора крахмала P и титруют до бледно-
розового окрашивания.
1 мл 0.1 M раствора натрия тиосульфата соответствует
23.79 мг CoCLoH2O.
Голубой раствор. 63 г меди сульфата P помещают в
мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в 900 мл
смеси, кислота хлороводородная P - вода Р[25.975),
доводят объем раствора этой же смесью до метки и
перемешивают. Определяют концентрацию полученного
раствора и разбавляют раствор этой же смесью
таким образом, чтобы содержание CuS04,5H2 0 в 1 мл
составляло 62.4 мг.
Определение концентрации. 10.0 мл полученного
раствора помещают в коническую колбу вместимостью
250 мл с притертой стеклянной пробкой, прибавляют
50 мл воды P1 12 мл кислоты уксусной разбавленной
Pw 3 г калия йодида Р. Выделившийся йод
титруют 0.1 M раствором натрия тиосульфата, прибавляют
в конце титрования в качестве индикатора
0.5 мл раствора крахмала P и титруют до бледно-
коричневого окрашивания.
1 мл 0.1 M раствора натрия тиосульфата соответствует
24.97 мг CuSO4,5H2O.
Стандартные растворы
Пять стандартных растворов готовят с использованием
трех исходных растворов в соответствии с указаниями
в Табл. 2.2.2.-1.
Таблица 2.2.2.-1
Объем в миллилитрах
Стандартный раствор Желтый
раствор
Красный
раствор
Голубой
раствор
Кислота хлороводородная
(10 г/л HCI)
В (коричневый) 3.0 3.0 2.4 1.6
BY (коричневато-желтый) 2.4 1.0 0.4 6.2
Y (желтый) 2.4 0.6 0.0 7.0
GY (зеленовато-желтый) 9.6 0.2 - 0.2 0.0
R (красный) 1.0 2.0 0.0 7.0
Растворы сравнения для методов I и Il
Растворы сравнения готовят из пяти стандартных растворов.
Таблица 2.2.2.-2
Растворы сравнения шкалы В
Таблица 2.2.2.-4
Растворы сравнения шкалы Y
Раствор
сравнения
Объем в миллилитрах
Стандартный
раствор В
Кислота хлороводородная
(10 г/л HCJ)
В.
I
75.0 25.0
в, 50.0 50.0
в, 37.5 62.5
в < 25.0 75.0
12.5 87.5
в, 5.0 95.0
В_ 2.5 97.5
- Ва 1.5 98,5
К 1.0 99.0
Таблица 2.2.2.-3
Растворы сравнения шкалы BY
Раствор
сравнения
Объем в миллилитрах
Стандартный
раствор BY
Кислота хлороводородная
(10 г/л HCI)
BY, 100.0 0.0
BY9 75.0 25.0
BY,
, J ,
50.0 50.0
BY. 25.0 75.0
12.5 87.5
I EL . 5.0 95.0
BY7 2.5 97.5
ХРАНЕНИЕ
Растворы сравнения для определения степени окраски
жидкостей по методу ) хранят в запаянных пробирках
из бесцветного прозрачного нейтрального стекла
с наружным диаметром 12 мм, в защищенном от света
месте.
Растворы сравнения, используемые для определения
степени окраски жидкостей по методу II, готовят из
соответствующих стандартных растворов непосредственно
перед использованием.
Раствор
сравнения
Объем в миллилитрах
Стандартный
раствор Y
Кислота хлороводородная
(10 г/л HCI)
., 100.0 0.0
Y, 75.0 25.0
50.0 50.0
., 25.0 75.0
.. 12.5 87.5
\ 5.0 95.0
Y7 2.5 97.5
Таблица 2.2.2.-5
Растворы сравнения шкалы GY
Раствор
сравнения
Объем в миллилитрах
Стандартный
раствор GY
Кислота хлороводородная
(10 г/л HCI)
GY1 25.0 75.0
GY, 15.0 85.0
GY, 8.5 91.5
GY, 5.0 95.0
GYS 3.0 97.0
GY, 1.5 98.5
GY7 0.75 99.25
Таблица 2.2.2.-6
Раствор сравнения шкалы R
Раствор
сравнения
Объем в миллилитрах
Стандартный
раствор R
Кислота хлороводородная
(10 г/л HCI)
R1 100.0 0.0
R, 75.0 25.0
R1 50.0 50.0
37.5 62.5
R, 25.0 75.0
R. 12.5 87.5
R-, 5.0 95.0
Сравнение степени окраски жидкости с растворами
сравнения (В, BY, Y, GY, R ) 1 3 обычно проводят по методу
f; в случае использования растворов сравнения
(В, BY, Y, GY, R ) 4 0 применяют метод II.
Степень окраски испытуемого образца не должна
превышать степень окраски соответствующего раствора
сравнения. Цвет испытуемого образца должен быть
максимально приближен к цвету соответствующего раствора
сравнения.
ХРАНЕНИЕ
Срок хранения исходных и стандартных растворов
1 год.
2.2.3. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН
рН - число, условно характеризующее концентрацию
ионов водорода в водных растворах. На практике
рН определяют экспериментально. рН испытуемого
раствора связано с рН стандартного раствора (pHJ
следующим уравнением:
рН - pHs = — ,
к
где
E - потенциал электрода в испытуемом растворе
в вольтах;
Е$ - потенциал того же электрода в растворе с
известным рН (рН ) в вольтах.
Температурный коэффициент (к), выраженный в вольтах,
при любой температуре может быть рассчитан
по формуле:
к - 0.05916 + 0.000198 (t - 25 °С).
Таблица 2.2.3.-1
Значения к при различных температурах
Температура 0C к
15 0.0572
20 0.0582
25 0.0592
30 0.0601
35 0.061 1
Потенциометрическое определение рН проводят путем
измерения разности потенциалов между двумя соответствующими
электродами, погруженными в испытуемый
раствор: один из электродов чувствителен к
ионам водорода (обычно стеклянный электрод), второй
- электрод сравнения (например, насыщенный
каломельный электрод).
Прибор. Измерительным прибором является вольтметр
с входным сопротивлением по крайней мере в
100 раз большим, чем сопротивление используемых
электродов. Прибор обычно градуируется в единицах
рН и он должен иметь такую чувствительность, чтобы
можно было обнаружить различие по крайней мере
0.05 единиц рН или 0.003 В.
Методика. Все измерения проводят при одной и той
же температуре в интервале от 20 0C до 25 0C при
отсутствии других указаний в частной статье. В табл.
2.2.3.-2 показана зависимость значений рН от температуры
для различных стандартных буферных растворов,
используемых для калибровки. При необходимости
учитывают температурные поправки в соответствии
с инструкцией предприятия-производителя. Прибор
калибруют при помощи буферного раствора калия
гидрофталата (первичный стандарт) и одного из буферных
растворов с другим значением рН (предпочтительно,
одного из приведенных в таблице 2.2.3.-2).
Показания прибора для третьего буферного раствора
с промежуточным значением рН не должны отличаться
больше, чем на 0.05 единиц рН от табличного
значения рН этого раствора. Электроды погружают в
испытуемый раствор и измеряют рН в тех же условиях,
что и для буферных растворов.
Если прибор используют часто, его калибровку проводят
регулярно. В противном случае, калибровка
прибора должна проводиться перед каждым измерением.
Все испытуемые растворы и стандартные буферные
растворы должны быть приготовлены на воде, свободной
от диоксида углерода, Р.
Приготовление стандартных буферных
растворов
0.05 M раствор калия тетраоксалата. 12.61 г
КС4Н303,2Н2 0 растворяют в воде, свободной от углерода
диоксида, P и доводят объем раствора тем
же растворителем до 1.0 л.
Насыщенный при 25 0C раствор калия гидротартра-
та. Избыток KC4H5O6 энергично встряхивают с водой,
свободной от углерода диоксида, P при температуре
25 0 C Фильтруют или декантируют. Раствор используют
свежеприготовленным.
0.05 M раствор калия дигидроцитрата. 11.41 г
KC6H-O, растворяют в воде, свободной от углерода
диоксида, P и доводят объем раствора тем же растворителем
до 1.0 л. Раствор используют свежеприготовленным.
0.05 Mраствор калия гидрофталата. 10.13 г KC8H5O4,
предварительно высушенного при температуре от
110 0C до 135 0C до постоянной массы, растворяют в
воде, свободной от углерода диоксида, P и доводят
объем раствора тем же растворителем до 1.0 л.
0.025 M роствор калия дигидрофосфата и 0.025 M
раствор натрия гидрофосфота. 3.39 г КН.,Р04 и 3.53 г
Na1HPO1., предварительно высушенных в течение двух
часов при температуре от 110 0C до 130 0C до постоянной
массы, растворяют в воде, свободной от
углерода диоксида P и доводят объем раствора тем
же растворителем до 1.0 л.
0.0087 M роствор калия дигидрофосфата и 0.0303 M
раствор динатрия гидрофосфата. 1.18 г KH0PO4 и
4.30 г Na2HPO4 , предварительно высушенных при
температуре от 110 0C до 130 °С, растворяют в воде,
свободной от углрода диоксида P и доводят объем
раствора тем же растворителем до 1.0 л.
0.01 M раствор натрия тетрабората. 3.80 г
Na1B4O1 1IOH1O растворяют в воде, свободной от углерода
диоксида, P и доводят объем раствора тем
же растворителем до 1.0 л. Хранят, защищая от диоксида
углерода.
0.025 M раствор натрия карбоната и 0.025 M раствор
натрия гидрокарбоната. 2.64 г Na2CO, и 2.09 г
NaHCO3 растворяют в воде, свободной от углерода
диоксида, P и доводят объем раствора тем же растворителем
до 1.0 л. Хранят, защищая от диоксида
углерода.
Насыщенный при 25 0C раствор кальция гидроксида
P. Ca(OH)2 встряхивают в течение часа с водой, свободной
от углерода диоксида P при 25 0C и после
отстаивания декантируют или фильтруют. Хранят, защищая
от диоксида углерода.
Таблица 2.2.3.-2
рН стандартных буферных растворов при различных температурах
Температура
0C
0.05 M
раствор
калия
тетраок-
салата
Насыще-
ный при
25 0C
раствор
калия
гидротар-
трата
0.05 M
раствор
калия
дигидро-
цитрата
0.05 M
раствор
калия
гидрофталата
0.025 M
раствор
калия
дигидрофосфата
и 0.025 M
раствор
натрия
гидрофосфата
0.0087 M
раствор
калия
дигидрофосфата
и
0.0303 M
раствор
натрия
гидрофосфата
0.01 M
раствор
натрия
тетрабората
0.025 M
раствор
натрия
карбоната
и 0.025 M
раствор
натрия
гидрокарбоната
Насыщенный
при
25 0C
раствор
к а л ь ц и я
гидроксида
кс,н3о8, K C 4 H 7 O 7 K C 8 H 5 O 4 K H 2 P O 4 + K H 2 P O 4 + N a В О
2 4 7
N a 2 C O 3 + C a ( O H ) 2
2 H 2 O N a 2 H P O 4 N a 2 H P O 4 10 H2O N a H C O 3
15 1.67 3.80 4.00 6.90 7.45 9.28 10.12 12.81
20 1.68 3.79 4.00 6.88 7.43 9.23 10.06 12.63
25 1.68 3.56 3.78 4.01 6.87 7.41 9.18 10.01 12.45
30 1.68 3.55 3.77 4.02 6.85 7.40 9.14 9.97 12.29
35 1.69 3.55 3.76 4.02 6.84 7.39 9.10 9.93 12.13
...'" +0.001 -0.0014 -0.0022 +0.0012 -0.0028 -0.0028 -0.0082 -0.0096 -0.034
at
Изменение рН но градус Цельсия.
' ^ * * C I » .. -'
Водородным показателем (..) называется отрицательный
десятичный логарифм активности ионов водорода.
рН = - Ig ан
+
Прибор. Подготовку прибора, электродной системы,
а также калибровку прибора проводят в соответствии
с инструкцией предприятия-производителя.
Допускается использование в качестве электрода сравнения
хлорсеребряного электрода, а также применение
электролитического мостика.
Приготовление стандартных буферных
растворов
Для приготовления стандартных буферных растворов
могут быть использованы реактивы квалификации «Для
рН-метрии», х.ч., ч.д.а. или реактивы импортного производства
соответствующей чистоты.
Допускается измерение рН в смешанных водно-органических
растворителях. В этих случаях, а также для
некоторых коллоидных систем полученные значения
рН являются условными. *--•·.··
2.2.4. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ РЕАКЦИЕЙ РАСТВОРА, ПРИБЛИЗИТЕЛЬНЫМ
ЗНАЧЕНИЕМ рН И ОКРАСКОЙ ИНДИКАТОРОВ
К 10 мл испытуемого раствора прибавляют 0.1 мл раствора индикатора, кроме исключений, указанных в
Табл. 2.2.4.-1.
Таблица 2.2.4.-1
Реакция
раствора
рН Индикатор Окраска
Щелочная > 8 Лакмусовая бумага красная P
Тимолового синего раствор P
Синий
Серый или фиолетово-синий
Слабо щелочная 8.0 -10.0 Фенолфталеина раствор P *
Тимолового синего раствор P
От бесцветного до розового
Серый
Сильно щелочная > 10 Фенолфталеиновая булюга P
Тимолового синего раствор P
Красный
Фиолетово-синий
Нейтральная 6.0 -
8.0
Метилового красного раствор P
Фенолового красного раствор P *
Желтый
Желтый
Нейтральный по
метиловому красному
4.5 -6.0 Метилового
красного раствор P
Оранжево-красный
Нейтральный по
фенолфталеину
< 8.0 Фенолфталеина раствор P г Бесцветный; розовый или
красный после прибавления
0.05 мл 0.1 M раствора
основания
Кислая < 6 Метилового красного раствор P
Бромтимолового синего раствор P 1
Оранжевый или красный
Желтый
Слабо кислая 4.0 - 6.0 Метилового красного раствора P
Бромкрезолового зеленого раствор
Оранжевый
Зеленый или синий
Сильно кислая < 4 Конго красного бумага P Зеленый или синий
' Используют 0.05 мл.
2.2.5. ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ПЛОТНОСТЬ
Относительная плотность d'j представляет собой отношение
массы определенного объема вещества при
температуре t, к массе равного объема воды при температуре
/\. При отсутствии других указаний исполь-
?о
зуют относительную плотность d го-
го
Относительную плотность также выражают как d 4 .
Плотность pVj вещества - это отношение массы вещества
к его объему при температуре 20 0C Плотность
выражают в килограммах на кубический метр
или в граммах на кубический сантиметр (1 кг-м"3 =
10'3 г-см"3).
Числовые соотношения между относительной плотностью
и плотностью, в килограммах на кубический сантиметр,
выражаются как:
р - 0.998203 • d 2 0
^20 20
d2 ° = 1.00180•P2 0,
P = 0.999972 · d 2 0
или
а 2 0 = 1.00003 · р20,
d 2 0 = 0.998230 · d 2 0
4 20
Относительную плотность или плотность измеряют с
помощью пикнометра (твердые вещества и жидкости),
гидростатических весов (твердые вещества), ареометра
(жидкости) или цифрового денситометра с осцил-
лографическим датчиком (жидкости и газы) с точностью
до третьего десятичного знака в соответствии с
указаниями в частной статье.
Атмосферным давлением при взвешивании пренебрегают,
так как связанная с этим ошибка не превышает
единицы в третьем десятичном знаке. При использовании
денситометра атмосферное давление
влияния не оказывает.
Денситометр с осциллографическим датчиком. Прибор
включает:
- U-образную трубку, изготавливаемую обычно из
боросиликатного стекла, которую заполняют испытуемой
жидкостью;
-магнито-электрическую или пьезо-электрическую систему
возбуждения, которая заставляет трубку вибрировать
как стрелку осциллятора при характеристической
частоте, зависящей от плотности испытуемой
жидкости;
- устройство для измерения периода колебаний (T);
период колебаний может быть преобразован в плотность,
непосредственно считываемую с прибора, или
может быть использован для расчета плотности с помощью
констант А и В, описанных ниже.
Резонансная частота ///является функцией жесткости
пружины (с) и массы системы (т):
1 1
2 =
4 .2
Следовательно:
M рх V
T2 = ( + - ) . ..2,
где
M - масса трубки,
V - внутренний объем трубки.
Введение двух констант А = с / (.. 2 . V) w В = M / V
приводит к классическому уравнению для осцилло-
графического датчика:
P T2 - В
Константы А и . определяют при работе на приборе
с U-образной трубкой, заполненной двумя различными
образцами известной плотности, например, дегазированной
воды P и воздуха. Контроль измерений
осуществляют ежедневно, используя дегазированную
воду Р. При этом результаты не должны отклоняться
от стандартного значения (р. = 0.998203 г-см3,
20 /и
d го = 1.000000) более допустимой ошибки. Например,
прибор, пригодный для измерений с точностью
до ± 0.0001 г-см3, должен показывать значение 0.9982
± 0.0001 г-см3. В противном случае необходима перенастройка.
Прибор регулярно калибруют по сертифицированным
материалам. Измерения проводят по
методике, применяемой для калибровки прибора. Во
избежание образования пузырьков и сокращения времени
измерения, при необходимости, испытуемую
жидкость перед введением в трубку термостатируют
при 20 0O
Факторы, влияющие на точность измерения:
- постоянство температуры по всей длине трубки;
- отсутствие линейности в области, превышающей
измеряемую плотность;
- фоновые резонансные эффекты;
- вязкость; для растворов с более высокой вязкостью,
чем вязкость калибровочной жидкости, измеряемые
значения плотности превышают истинные значения.
Для исключения влияния вязкости и нелинейности калибровочные
и испытуемые жидкости должны иметь близкие
значения плотности (± 5 %) и вязкости (± 50 %).
Денситометр может автоматически корректировать
вязкость и ошибки, возникающие вследствие изменения
температуры и отсутствия линейности.
Точность является функцией повторяемости и устойчивости
частоты колебании, которая зависит от постоянства
объема, массы и жесткости пружины ячейки.
Погрешность измерений на денситометре лежит в
пределах от 1 . 103г-см3до 1 . 10-"гсм'-\ а повторяемость
- от 1 \ 10"* г см"! до 1 \ Ю"-" тем"3.
В тех случаях, когда для вещества регламентируют
значение плотности, ее определение проводят одним
из нижеперечисленных методов при отсутствии других
указании в частной статье.
Метод 1 . Применяют в случае определения плотности
(г, см°) жидкостей с точностью до 103.
Чистый сухой пикнометр взвешивают с точностью до
2 -10"* г, заполняют с помощью сухой воронки водой
очищенной немного выше метки, закрывают пробкой
и выдерживают в течение 20 мин в термостате, в котором
поддерживают постоянную температуру воды
20 0C с точностью до 0,1 0 C При этой температуре
уровень воды в пикнометре доводят до метки, быстро
отбирая излишек воды при помощи пипетки или свернутой
в трубку полоски фильтровальной бумаги. Пикнометр
снова закрывают пробкой и выдерживают в
термостате еще 10 мин, проверяя положение мениска
по отношению к метке. Затем пикнометр вынимают
из термостата, фильтровальной бумагой вытирают
внутреннюю поверхность горлышка пикнометра, а
также весь пикнометр снаружи, оставляют под стеклом
аналитических весов в течение 10 мин и взвешивают
с той же точностью.
Пикнометр освобождают от воды, высушивают, споласкивая
последовательно спиртом этиловым и эфиром
(сушить пикнометр путем нагревания не допускается),
удаляют остатки эфира продуванием воздуха,
заполняют пикнометр испытуемой жидкостью и затем
производят то же операции, что и с водой очищенной
Плотность (г/см') вычисляют по формуле:
( т . - т) • 0.99703
. „. - — : + 0.0012,
т . - т
где
т - масса пустого пикнометра в граммах;
т , - масса пикнометра с водой очищенной в гром-
мах;
т . ~ масса пикнометра с испытуемой жидкостью
в граммах;
0.99703 - значение плотности воды очищенной при
2 0 0C (в г/см-' с учетом плотности воздуха):
0.0012 - плотность воздуха при 20 °С и барометрическом
давлении 1013 гПа (760 мм.рт.ст.).
Метод 2. Применяют в случае определения плотности
(г ..:'. жидкостей с точностью до 0.01.
Испытуемую жидкость помещают в цилиндр и при температуре
жидкости 20 0C осторожно опускают в нее
чистый сухой ареометр, на шкале которого предусмотрена
ожидаемая величина плотности. Ареометр
не выпускают из рук до тех пор, пока не станет очевидным,
что он плавает, при этом необходимо следить,
чтобы ареометр не касался стенок и дна цилиндра.
Отсчет производят через 3-4 мин после погружения
по делению на шкале ареометра, соответствующему
нижнему мениску жидкости.
Примечание. Определение плотности легколетучих
веществ ареометром не допускается.
Метод 3. Применяют для определения плотности
(г см-!) твердых жиров и воска. Точно взвешивают пустой
пикнометр, затем взвешивают тот же пикнометр,
наполненный водой очищенной, температура которой
20 0 C После этого воду удаляют и пикнометр
высушивают. Все операции проводят, соблюдая условия,
указанные в методе 1.
В пикнометр вливают при помощи пипетки или небольшой
воронки с тонко оттянутым концом расплавленный
жир или воск в таком количестве, чтобы он
занимал 1/3 - 1/2 объема пикнометра. Пикнометр
ставят на 1 ч без пробки в горячую воду, затем охлаждают
до 20 0C и взвешивают; доводят до метки
водой очищенной при 20 0C, вытирают насухо и вновь
взвешивают. В обеих фазах на поверхности их раздели
не должно быть пузырьков воздуха.
Плотность (г/см-*) вычисляют по формуле;
(т., - т) • 0.99703
. ; j '. + 0.0012,
(т + т J ~ (т - т J
где
т - масса пустого пикнометра в граммах;
гп, ~ масса пикнометра с водой очищенной в граммах;
я?, - масса пикнометра с жиром в граммах;
т . - масса пикнометра с жиром и водой очищенной
в граммах.
2.2.6. ПОКАЗАТЕЛЬ ПРЕЛОМЛЕНИЯ
(ИНДЕКС РЕФРАКЦИИ)
Показатель п} преломления среды относительно воздуха
равен отношению синуса угла падения луча света
в воздухе к синусу угла преломления луча света в
данной среде.
При отсутствии других указаний в частной статье определение
показателя преломления проводят при температуре
20 ± 0.5 0C и длине волны линии D спектра
натрия (. = 589.3 нм); показатель преломления, определенный
при таких условиях, обозначают индек-
20
сом . .
D
Рефрактометры обычно определяют критический угол.
В таких приборах основной частью является призма с
известным показателем преломления, находящаяся в
контакте с анализируемой жидкостью.
Для калибровки приборов используют стандартные
жидкости, указанные в Табл. 2.2.6.-1. Значение показателя
преломления каждой стандартной жидкости указывается
на этикетке.
Таблица 2.2.6.-1
Стандартная
жидкость
../At
(температурный
коэффициент)
Триметилпенган СО ГФ PK -0.00049
Толуол СО ГФ PK -0.00056
Метилнофтолин СО Г . PK -0.00048
При использовании белого света рефрактометры должны
быть снобжены компенсационной системой. Прибор
должен давать показания с точностью как минимум
до третьего десятичного знака и обеспечивать
возможность проведения операций при заданной температуре.
Цена деления термометра не должна превышать
0.5 0O
К факторам, влияющим на величину показателя преломления,
относятся:
температура испытания;
длина волны;
концентрация раствора;
природа растворителя.
Метод рефрактометрии применяют для установления
подлинности, химической чистоты, содержания вещества
в растворе по графику зависимости показателя
преломления от концентрации раствора. Диапазон
значений показателя преломления, измеряемого в
проходящем свете, должен быть 1,3 - 1,7, точность
измерения при этом должна быть не ниже + 210'4 . На
графике выбирают интервал концентраций, в котором
соблюдается линейная зависимость.
Концентрацию вещества (х) в растворе вычисляют также
по формуле:
. - пс
X = ' г
F
где
. - показатель преломления раствора;
п0 - показатель преломления растворителя
при той же температуре;
F - фактор, равный величине прироста показателя
преломления при увеличении концентрации
на 1 % (устанавливается экспериментально).
Для калибровки рефрактометров кроме стандартных
жидкостей, указанных в таблице 2.2.6.-1, используют
воду очищенную, для которой . 2 0 = 1.3330
(../At = - 85-10'6).
2.2.7. ОПТИЧЕСКОЕ ВРАЩЕНИЕ
Оптическое вращение - это свойство вещества вращать
плоскость поляризации поляризованного света.
Оптическое вращение считают положительным (+) для
правовращающих веществ (т.е. веществ, вращающих
плоскость поляризации по часовой стрелке) и отрицательным
(-) для левовращающих веществ.
Удельное оптическое вращение [сс ] ' ; , выраженное
в радианах (рад), представляет собой вращение,
вызванное слоем жидкости или раствора толщиной
1 метр, содержащим 1 килограмм оптически
активного вещества в 1 метре кубическом при прохождении
через него поляризованного света с длиной
волны . при температуре t. Для практических
целей удельное оптическое вращение [а ]', обычно
выражают в миллирадиан-метрах квадратных на
килограмм (мрад-м2-кг '').
В Фармакопее используют следующие определения.
Угол оптического вращения жидких веществ представляет
собой угол вращения плоскости поляризации а,
выраженный в градусах (°), при длине волны линии D
спектра натрия (. = 589.3 нм), измеренный при температуре
20 0C в толщине слоя 1 дециметр. Для растворов
способ приготовления указывают в частной
статье.
Удельное оптическое вращение [а] 2° жидкости представляет
собой угол вращения плоскости поляризации
а, выраженный в градусах (°), при длине волны
линии D спектро натрия (. = 589.3 нм), измеренный
при температуре 20 0 C рассчитанный для толщины
слоя 1 дециметр испытуемого вещества и деленный
на плотность, выраженную в граммах на кубический
сантиметр.
Удельное оптическое вращение [а] 2 ° вещества в растворе
представляет собой угол вращения плоскости
поляризации а, выраженный в градусах (°), при длине
волны линии D спектра натрия (. = 589.3 нм), измеренный
при температуре 20 0C в растворе испытуемого
вещества, и рассчитанный для слоя 1 дециметр
в пересчете на содержание 1 грамма вещества в
1 миллилитре раствора. Для удельного вращения вещества
в растворе всегда указывают используемый
растворитель и концентрацию раствора.
В Фармакопее удельное оптическое вращение выражают
в градус-миллилитрах на дециметр-грамм
[(с)- мл-дм-'-Г1].
Пересчет удельного вращения в единицах по Международной
Системе в единицы, используемые Фармакопеей,
проводят по формуле.
[.. = [.]'. -0.1745
В отдельных случаях, указанных в частной статье, угол
вращения может быть измерен при температурах,
отличных от 20 °С, и при других длинах волн.
Используемый поляриметр должен обеспечивать измерения
с точностью до 0.01°. Шкалу обычно проверяют
при помощи сертифицированных кварцевых пластинок.
Линейность шкалы может быть проверена при
помощи растворов сахарозы.
Методика. Определяют ноль поляриметра и угол
вращения плоскости поляризации при длине волны
линии D спектра натрия (. = 589.3 нм) при температуре
20 ± 0.5 0 C Измерения оптического вращения
могут проводиться при других температурах только в
тех случаях, если в частной статье указан способ учета
температуры. Определяют ноль прибора с закрытой
трубкой; для жидкостей - с пустой трубкой; для
растворов твердых веществ - с трубкой, заполненной
соответствующим растворителем. Проводят не
менее пяти измерений и рассчитывают среднее значение.
Удельное оптическое вращение вычисляют по формулам,
обозначая правое и левое вращение соответственно
(+) и (-).
Для жидкостей:
[а]
[а]
1000 · а
/ •
где
с - концентрация раствора в г/л.
Содержание с или с растворенного вещества . г/л
или . процентах [м/м] соответственно, рассчитывают
по формулам:
1000 · а
с =
/ • [ а ]
1000 • а
/ . 1 20
где
Для веществ в растворе:
а - угол вращения, измеренный при температуре
20 ± 0.5 0C в градусах;
/ - длина поляриметрической трубки в дециметрах;
p2Q - плотность при температуре 20 0C в граммах
на кубический сантиметр. 11 , < и"
В фармакопейном анализе плотность заменяют относительной
плотностью (2.2.5).
2.2.8. ВЯЗКОСТЬ
Динамическая вязкость или коэффициент вязкости . -
это приходящаяся на единицу поверхности тангенциальная
сила, называемая также напряжением сдвига
т, выраженная в паскалях (Па), которую необходимо
приложить для того, чтобы переместить слой жидкости
площадью 1 м2 со скоростью (.) 1 метр в секунду
(м'с"'), находящийся на расстоянии (.) 1 метр относительно
другого слоя, параллельно плоскости скольжения.
Величина dv/dx представляет собой градиент скорости
и определяет скорость сдвига D1 выраженную в
обратных секундах (с'), таким образом:
. - X)D
Единицей динамической вязкости является паскаль-
секунда (Пах). Наиболее часто используемой дольной
единицей является миллипаскаль-секунда (мПах).
Кинематическую вязкость ., выраженную в метрах
квадратных на секунду (м:'С'), получают делением ве-
личины динамической вязкости . на плотность жидкости
р, выраженную в килограммах на метр кубический
(кгм~3), измеренную при той же температуре, то
есть:
. = . Ip
Кинематическую вязкость обычно выражают в миллиметрах
квадратных на секунду (мм2 х- 1 ).
Для определения вязкости ньютоновских жидкостей
может быть использован капиллярный вискозиметр; для
определения вязкости как ньютоновских, так и неньютоновских
жидкостей может быть использован ротационный
вискозиметр.
Допускается использование и других вискозиметров
при условии, что точность и правильность измерений
будут не хуже, чем в случае использования вискозиметров,
описываемых ниже.
отнесенная к единице концентрации раствора:
. =// /с,
' прив 'уд
где
с - концентрация раствора.
Для определения структурных характеристик полимеров
приведенную вязкость экстраполируют к нулевой
концентрации. В этом случае вводят понятие характеристической
вязкости [.]:
[.] = lim . = lim .
с-+0
прм
с-+0 . . '
Характеристическая вязкость выражается в единицах,
обратных единицам концентрации.
2.2.9. МЕТОД КАПИЛЛЯРНОЙ
ВИСКОЗИМЕТРИИ
Вязкость (внутреннее трение) - свойство текучих тел
оказывать сопротивление перемещению одной их
части относительно другой. Вязкость ;/ является важной
характеристикой простых жидкостей и растворов.
Жидкости, для которых вязкость зависит только от
концентрации и температуры, называются ньютоновскими,
а все другие - неньютоновскими.
Для ньютоновских жидкостей различают динамическую,
кинематическую, относительную, удельную, приведенную
и характеристическую вязкости. Для ненью-
тоновсих жидкостей характерна структурная вязкость
— вязкость при данном напряжении сдвига.
Динамическую вязкость обычно выражают в пуазах
(Пз) или сантипуазах (сПз). Кинематическую вязкость
выражают в стоксах (Ст) или сантистоксах (сСт).
При определении вязкости одной жидкости относительно
другой находят относительную вязкость ;/оги
Часто используют удельную вязкость . v которая показывает
влияние растворенного вещества на вязкость
раствора:
h/h. - I = A
О о,
где
. - вязкость раствора;
I ] 0 - вязкость растворителя.
Приведенная вязкость - это удельная вязкость,
Определение вязкости проводят, используя подходящий
капиллярный вискозиметр, при температуре
20 ± 0.1 °С, если не указана другая температура в
частной статье. Время истечения жидкости от одного
деления вискозиметра до другого деления измеряется
секундомером с точностью до одной пятой секунды.
Полученные данные являются приемлемыми при условии,
что результаты двух последовательных измерений
отличаются не более чем на 1 %.
Время истечения испытуемой жидкости определяют как
среднее не менее чем трех измерений.
Динамическую вязкость . (2.2.8), выраженную в мил-
липаскаль-секундах (мПах), рассчитывают по формуле:
. = kpt,
где
к - постоянная вискозиметра, в миллиметрах
квадратных на секунду квадратную (мм2х"2);
. — плотность испытуемой жидкости, в миллиграммах
на миллиметр кубический (мг-мм"3), полученная
умножением относительной плотности (d 2 0 )
на 0.9982;
t — время истечения испытуемой жидкости в
секундах (с).
Постоянную к определяют с использованием подходящей
фармакопейной жидкости для калибровки вискозиметров.
Кинематическую вязкость, выраженную в миллиметрах
квадратных на секунду (мм2х"'), рассчитывают по
формуле:
. = / : /
Таблица 2.2,9.-1
Раз
мер
Номинальная
постоянная
вискозиметра
Диапазон
кинематической
вязкости
Внутренний
диаметр трубки
/г
Объем
расширения
С
Внутренний
диаметр
трубки N
M M 2 'С~2 M M 2 'C"1 M M
(± 2 %)
мл
(± 5 %)
M M
1 0.01 3.5 - 10 0.64 5.6 2.8-3.2
IA 0.03 6 - 30 0.84 5.6 2.8-3.2
2 0.1 2 0 - 1 00 1.15 5.6 2.8-3.2
2А 0.3 60 - 300 1.51 5.6 2.8-3.2
3 1.0 200 - 103 2.06 5.6 3.7-4.3
ЗА 3.0 600 - 3-103 2.74 5.6 4.6-5.4
4 10 2•1O3- 104 3.70 5.6 4.6-5.4
4А 30 6•1O3- 3•1O4 4.07 5.6 5.6-6.4
5 100 2•1O4- 105 6.76 5.6 6.8-7.5
Определение вязкости может проводиться с помощью
прибора1'1 (рис. 2.2.9.-1), характеристики которого
указаны в Табл. 2.2.9.-1:
Минимальное время истечения должно составлять
350 с в случае размера 1 и 200 с - во всех остальных
случаях.
Методика. Испытуемую жидкость, имеющую температуру
20 0C, если не указана другая температура в
частной статье, заливают в вискозиметр через трубку
(L) в таком количестве, чтобы заполнить расширение
(А), но при этом уровень жидкости в расширении (В)
должен остаться ниже выхода в вентиляционную трубку
(M). Вискозиметр погружают в вертикальном положении
в водяную баню при температуре 20 ± 0.1 0C,
если не указана другая температура в частной статье,
удерживая его в этом положении не менее 30 мин
для установления температурного равновесия. Трубку
(M) закрывают и повышают уровень жидкости в
трубке (N), таким образом, чтобы он находился примерно
на 8 мм выше метки (E). Удерживают жидкость
на этом уровне, закрыв трубку (N) и открыв трубку
(M). Затем открывают трубку (N) и измеряют время,
за которое уровень жидкости понизится от метки (E)
до метки (F)1 секундомером с точностью до одной пятой
секунды.
111 В Государственной Фармакопее PK(по аналогии с Европейской Фармакопеей/ описывается система, предложенная Международной
Организацией по Стандартизации.
L M N
. ) E
Ot
го
CM
R
о . R
O CN
_ 1 в
о
со
с А J
J
I
Рисунок. 2.2.9.-1. - Вискозиметр с висячим уровнем
Размеры приведены в миллиметрах
Для измерения кинематической и динамической вяз-
костей применяют капиллярные вискозиметры типа
ВПЖ и вискозиметры Оствальда и Уббелоде с различными
модификациями. Капиллярные вискозиметры
используют для определения вязкости при одном значении
скорости сдвига и применяют в основном для
исследования ньютоновских жидкостей. При работе
на вискозиметре учитывают К - постоянную прибора,
обычно выражаемую в мм--с-, которую рассчитывают
по формуле:
К - ,тт?'р Н/Ш,
где
RuL- радиус и длина капилляра прибора;
H - средняя высота жидкости;
д - ускорение силы тяжести;
V - объем вытекающей жидкости.
Для определения вязкости в каждом конкретном случае
капиллярные вискозиметры выбирают по известным,
значениям К и И в зависимости от характера
изучаемой жидкости, ее объема и значения вязкости.
Для определения относительной вязкости измеряют
время истечения между верхней и нижней меткой вискозиметра
той жидкости, относительно которой проводят
измерение . Затем в том же чистом и сухом
вискозиметре определяют время истечения испытуемой
жидкости.
Одновременно измеряют плотности (р,р0) изучаемых
жидкостей пикнометром при той же температуре, при
которой определяют и рассчитывают относительную
вязкость по формуле:
Пою" fPl fuPo
Для определения характеристической вязкости готовят
не менее 5 растворов различной концентрации.
При этом должно выполняться условие возможности
применения метода линейной экстраполяции приведенной
вязкости к нулевой концентрации, т.е. концентрации
раствора следует выбирать минимальными в
пределах чувствительности и точности метода измерения.
Для каждой концентрации раствора определяют
. и . и рассчитывают приведенную вязкость.
Затем строят зависимость // ^ от концентрации С и
графически или линейным методом наименьших квад-
К промышленным вискозиметром прилагается таблица со
сти цилиндров и скорости их вращения.
ратов экстрополируют приведенную вязкость к нулевой
концентрации, т.е. находят характеристическую
вязкость.
2.2.10. МЕТОД РОТАЦИОННОЙ
ВИСКОЗИМЕТРИИ
Принцип действия наиболее часто используемых ротационных
вискозиметров заключается в измерении
силы сдвига в жидкой среде, расположенной между
двумя коаксиальными цилиндрами, один из; которых
вращается двигателем, а второй приводится во вращение
первым. Вязкость (структурная, эффективная или
кажущаяся вязкость) характеризуется углом (M)1 на
который поворачивается второй цилиндр; этот угоп
пропорционален моменту силы, выраженному в ньютон-
метрах (Н'м).
В случае ламинарного потока, динамическую вязкость
., выраженную в паскаль-секундах (Пах), рассчитывают
по формуле:
IiJL) (J J)
. .\4.-....;( R'J '
где
h - глубина погружения (м) второго цилиндра в жидкую
среду,
Рл -радиус меньшего из цилиндров в метрах;
R„ - радиус большего из цилиндров в метрах;
. - угловая скорость в радианах на секунду.
Постоянная вискозиметра к р1 может быть определена
при разных скоростях вращения с использованием
фармакопейных жидкостей для калибровки вискозиметров.
При этом вязкость рассчитывают по формуле:
M
' .
Методика. Вязкость измеряют в соответствии с инструкцией
по применению ротационного вискозиметра.
Температуру, при которой измеряют вязкость, указывают
в частной статье. Для псевдопластических и
других неньютоновских систем в частной статье указывают
тип вискозиметра и угловую скорость или скорость
сдвига, при которых проводят измерения. Если
невозможно получить точное значение указанной скорости,
измерения проводят при несколько большей и
несколько меньшей скоростях. Полученные результаты
интерполируют.
и/» постоянных вискозиметров в зависимости от площади поверхно-
Ротационные вискозиметры обычно используются для
измерения динамической вязкости. Они представляют
собой системы с жесткими соосно расположенными
цилиндрами, конусами или дисками, в которых осуществляется
сдвиговое течение.
Ротационные вискозиметры позволяют определять
реологические свойства жидкостей в широком диапазоне
скоростей сдвига, что особенно важно для неньютоновских
жидкостей.
Допускается использование различных типов ротационных
вискозиметров с коаксиальными цилиндрами, у
которых вращается два или только один цилиндр.
2.2.11. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
ПЕРЕГОНКИ
Температурные пределы перегонки представляют собой
интервал температур, приведенный для давления
101.3 кПа (760 мм рт. ст.), в пределах которого перегоняется
жидкость или определенная ее фракция в
предусмотренных условиях.
Прибор. Прибор (см. Рис. 2.2.11.-1) состоит из перегонной
колбы (A)1 прямого холодильника (В), присоединенного
к колбе с боковой стороны, и вставной
трубки (аллонжа) (С), присоединенной к концу холодильника.
В горловину колбы помещают термометр
таким образом, чтобы верхний конец ртутного резервуара
находился на 5 мм ниже от нижнего края присоединения
отводной трубки перегонной колбы. Применяют
термометр с диапазоном шкалы около 50 0C
и ценой деления 0.2 °С. Во время испытания колбу,
включая и горловину, защищают от охлаждения соответствующим
экраном.
Методика. 50.0 мл испытуемой жидкости и несколько
кусочков пористого материала помещают в колбу
(А). Для жидкостей, кипящих при температуре ниже
150 0C, необходимо охлаждение циркулирующей водой.
Колбу нагревают таким образом, чтобы быстро
достичь кипения, и отмечают температуру, при которой
в цилиндр попадают первые капли дистиллята.
Устанавливают нагрев, обеспечивающий перегонку от
2 мл до 3 мл в минуту и отмечают температуру, при
которой вся жидкость или предусмотренная фракция,
объем которой измеряют при температуре 20 0C, перегнаны.
Дистиллят собирают в цилиндр вместимостью
50 мл с ценой деления 1 мл.
Вносят поправку в наблюдаемые температуры для
приведения к нормальному давлению по формуле:
/, - t2 + к /101.3 - Ь),
где
Z1 - исправленная температура в градусах
Цельсия;
t - наблюдаемая температура при давлении
Ь в градусах Цельсия;
к - поправочный коэффициент берут, при
необходимости, из таблицы 2.2.11.-1;
b - барометрическое давление в процессе
перегонки, в килопаскалях.
Таблица 2.2.11.-1
Поправочный коэффицент для приведения
к нормальному давлению
Температура
перегонки
Поправочный
коэффициент к
до 100 0C 0.30
от 100 0C до 140 0C 0.34
от 140 0C до 190 0C 0.38
от 190 0C до 240 0C 0.41
выше 240 0C 0.45
Рисунок 2.2.11.-1. Прибор для определения температурных пределов перегонки
Размеры указаны в миллиметрах
2.2.12. ТЕМПЕРАТУРА КИПЕНИЯ
Температура кипения - это температура, при которой
давление насыщенного пара над жидкостью равно
101.3 кПа.
Прибор. Для определения температуры кипения применяют
тот же прибор, что и для определения температурных
пределов (2.2.11). При этом термометр устанавливают
таким образом, чтобы нижний конец
ртутного резервуара находился на уровне нижнего
края отводной трубки перегонной колбы. Колбу помещают
на лист изоляционного материала, имеющего
отверстие диаметром 35 мм.
Методика. В колбу (А)помещают 20 мл испытуемой
жидкости и несколько кусочков пористого материала.
Колбу нагревают таким образом, чтобы быстро достичь
кипения и отмечают температуру, при которой
жидкость переходит из отводной трубки в холодильник.
Вносят поправку в наблюдаемые температуры для
приведения к норА/альному давлению по формуле:
/, - L + k ( 101.3 - Ь),
t2 - наблюдаемая температура при давлении Ь;
к - поправочный коэффициент, приведенный в
Таблице 2.2.11.-1;
Ь - барометрическое давление во время
определения в килопаскапях.
Температура кипения - это температура, при которой
давление насыщенного пара над жидкостью равно
атмосферному давлению.
Нордлальное атмосферное давление составляет
101.3 кПа. В ряде условий (например, высокогорье)
атмосферное давление ниже значения, соответствующего
нормальному давлению. В связи с этим температура
кипения жидкостей в указанных условиях отличается
от измеренной при нормальном атмосферном
давлении.
где
tt - скорректированная температура;
2.2.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДЫ
МЕТОДОМ ПЕРЕГОНКИ
Прибор (см. Рис. 2.2.13.-1) состоит из стеклянной
колбы (А), которая соединена трубкой (D) с цилиндрической
трубкой (B)1 снабженной градуированным
приемником (E) и обратным холодильником (CJ.
Цена деления приемника (E) 0.1 мл. В качестве источника
нагревания преимущественно используют
электрический нагреватель с реостататом или масляную
баню. Верхняя часть колбы и соединительная
трубка могут быть покрыты теплоизоляцией.
Методика. Приемник и холодильник прибора очищают,
тщательно промывают водой и высушивают.
200 мл толуола P и около 2 мл воды P помещают
в сухую колбу и перегоняют в течение 2 ч. Колбу
оставляют для охлаждения на 30 мин и записывают
объем воды с точностью до 0.05 мл. В колбу
помещают количество вещества, взвешенное с точностью
до 1 %, содержащее приблизительно от
2 мл до 3 мл воды. Если вещество имеет пастообразную
консистенцию, его взвешивают в лодочке
из металлической фольги. В колбу вносят несколько
кусочков пористого материала и осторожно
нагревают в течение 15 мин. Когда толуол начинает
кипеть, перегоняют со скоростью около двух
капель в секунду до тех пор, пока большая часть
воды не перегонится, а затем повышают скорость
перегонки до около четырех капель в секунду. Когда
вода перегонится полностью, внутреннюю трубку
холодильника промывают толуолом Р. Перегонку
продолжают в течение 5 мин, затем нагреватель
убирают, дают приемнику остыть до комнатной
температуры и стряхивают все капли воды,
прилипшие к стенкам приемника. После полного
разделения воды и толуола записывают объем воды
и рассчитывают ее содержание в мл/кг в веществе
по формуле:
1000 (п? - п.)
m
где
/77 - масса испытуемого вещества в граммах;
. - объем воды, полученный при первой перегонке,
в миллилитрах;
/?, - общий объем воды, полученный при двух перегонках,
в миллилитрах.
Кипячение прекращают, когда объем воды в приемнике
перестанет увеличиваться и верхний слой
растворителя в приемнике станет прозрачным.
Рисунок 2.2.13.-1
Прибор для определения воды
методом перегонки
Размеры указаны в миллиметрах
2.2.14. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ -
КАПИЛЛЯРНЫЙ МЕТОД
Температура плавления, определенная капиллярным
методом, представляет собой температуру, при которой
последняя твердая частичка уплотненного столбика
вещества в капиллярной трубке переходит в
жидкую фазу.
При отсутствии других указаний в частной статье, тот
же прибор и методику применяют для определения
других показателей, таких как образование мениска
или диапазона плавления, характеризующих поведение
вещества при плавлении.
Прибор. Составными частями прибора являются:
- подходящий стеклянный сосуд, содержащий жидкость
(например, воду, вазелиновое или силиконовое масло),
используемый в качестве бани и оснащенный подходящим
устройством для нагрева;
- подходящее устройство для перемешивания, обеспечивающее
однородность температуры внутри бани;
- подходящий термометр с меткой погружения и ценой
деления не более 0.5 0 C Разность между верхним
и нижним делениями термометра в области измеряемой
температуры - не более 100 °С;
- запаянные с одного конца капиллярные трубки из
бесщелочного тугоплавкого стекла, диаметром от
0.9 мм до 1.1 мм и толщиной стенок от 0.10 мм до
0.15 мм.
Методика. При отсутствии других указаний в частной
статье, тонкоизмельченное в порошок вещество
сушат в вакууме (2.2,32, способ Ь) над силикагелем
безводным Рв течение 24 ч. Достаточное количество
вещества вводят в капиллярную трубку до получения
уплотненного столбика высотой от 4 мм до 6 мм.
Повышают температуру бани приблизительно на
10 0C ниже предполагаемой температуры плавления
и продолжают нагревание со скоростью около 1 °С
в мин. Когда температура достигнет значения на 5 °С
ниже предполагаемой температуры плавления, помещают
капиллярную трубку в прибор. При использовании
прибора, описанного выше, капиллярную трубку
погружают в баню так, чтобы ее запаянный конец
находился на уровне центра шарика термометра,
метка погружения которого находится на уровне поверхности
жидкости. Отмечают температуру, при которой
последняя твердая частичка переходит в жидкую
фазу.
Калибровка прибора. Для калибровки прибора
используют температуру плавления таких веществ, как
стандартные образцы Всемирной Организации Здравоохранения
или другие подходящие вещества, пригодные
для этих целей.
Капиллярный метод применяют для определения температуры
плавления твердых веществ, легко превращаемых
в порошок.
Необходимое уплотнение вещество при заполнении
капиллярной трубки можно получить, если ее несколько
раз бросить запаянным концом вниз в стеклянную
трубку длиной не менее 1.0 м, поставленную вертикально
на твердую поверхность.
Проводят не менее двух определений. За температуру
плавления принимают среднее значение. Расхождение
между определениями не должно превышать
1 0C
Допускается применение других приборов, использующих
капиллярный метод, при условии, что точность
и правильность измерений будут не хуже, чем в случае
применения прибора, описанного выше.
Весь процесс плавления протекает в течение определенного
промежутка времени и определенного интервала
температур: началод/ плавления - появлением
первой капли жидкости и концом плавления (температурой
плавления) - полным переходом вещества
. жидкое состояние. Этот интервал температур, называемый
диапазоном плавления, не должен превышать
2 0C при отсутствии других указаний в частной
статье.
Целый ряд органических соединений при плавлении
разлагается (происходит резкое изменение внешнего
вида вещества, например вспенивание). Такую температуру
называют температурой разложения. Она в
значительной мере зависит от скорости нагрева, поэтому
при определении температуры разложения в
частных статьях указывают скорость нагрева. Наряду
с определением температуры плавления при отсутствии
других указаний в частной статье, прибор и
методику, описанные в этом разделе, применяют для
определения диапазона плавления или температуры
разложения.
2.2.15. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ -
ОТКРЫТЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ МЕТОД
Для некоторых веществ определяют температуру разжижения,
называемую обычно температурой плавления.
Определение проводят следующим методом.
Используют стеклянную капиллярную трубку, открытую
с обоих концов, длиной около 80 мм, наружным
диаметром от 1.4 мм до 1.5 мм и внутренним диаметром
от 1.0 мм до 1.2 мм.
Вещество, предварительно обработанное в соответствии
с указаниями в частной статье, помещают в
каждую из пяти капиллярных трубок в количестве, достаточном
для формирования в каждой трубке столбика
высотой около 10 мм. Трубки оставляют на определенное
время при температуре, указанной в частной
статье.
При отсутствии других указаний вещества с воскообразной
консистенцией перед введением в капиллярные
трубки осторожно и полностью расплавляют на
водяной бане. Трубки оставляют на 2 часа при температуре
от 2 0C до 8 0C
Прикрепляют одну из капиллярных трубок к термометру
с ценой деления 0 5 0C таким образом, чтобы
вещество находилось в непосредственной близости к
шарику термометра.
Термометр с прикрепленной капиллярной трубкой
помещают в стакан так. чтобы расстояние между дном
стакана и нижней частью шарика термометра составляло
1 см, Стокан наполняют водой так, чтобы высота
слоя составляла 5 см. Повышают температуру воды
со скоростью 1 0C в мин.
За температу-ру плавления принимают температуру,
при которой вещество начинает подниматься по капиллярной
трубке.
Повторяют эту операцию с четырьмя другими капиллярными
трубками и рассчитывают результат как среднее
из пяти показаний.
Открытый капиллярный метод применяют для веществ,
имеющих аморфную структуру, не растирающихся в
порошок и плавящихся ниже температуры кипения
воды, таких как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы.
Если столбик вещества не поднимается в капилляре,
за температуру плавления принимают температуру,
при которой столбик вещества в капилляре становится
прозрачным.
2.2.16. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ -
МЕТОД МГНОВЕННОГО ПЛАВЛЕНИЯ
Температуру плавления по этому методу рассчитывают
по формуле:
f , + t 2
2
где
t~ первая температура;
/,-вторая температура, определяемые в условиях,
приведенных ниже.
Прибор. Прибор состоит из металлического блока,
изготовленного из материала, обладающего высокой
теплопроводностью и не взаимодействующего с испытуемым
веществом, наприм.ер, из латуни. Верхняя
поверхность блока должна быть плоской и тщательно
отполированной. Блок равномерно нагревают по всей
массе газовой горелкой с микрорегулировкой или
электрическим нагревателем с тонкой регулировкой.
Блок имеет достаточно широкую цилиндрическую полость
для размещения термометра, столбик ртути которого
должен находиться в одном и том же положении
как при калибровке, так и при определении температуры
плавления испытуемого вещества. Цилиндрическая
полость размещена параллельно отполированной
верхней поверхности блока и на расстоянии
около 3 мм от нее. Прибор калибруют, используя
подходящие вещества с известной температурой плавления.
Методика. Блок быстро нагревают до температуры
на 10 0 C ниже предполагаемой температуры плавления
и затем устанавливают скорость нагрева около
1 0 C в мин. Несколько частичек тонкоизмельченного
в порошок вещества, высушенного в вакууме (2.2.32,
способ Ь) над силикагелем безводным P в течение
24 ч, бросают через равные промежутки времени на
поверхность блока в непосредственной близости от
шарика термометра, очищая поверхность после каждого
испытания. Записывают температуру / ; , при которой
вещество плавится мгновенно при соприкосновении
с металлом. Останавливают нагрев. Во время
охлаждения через равные промежутки времени бросают
несколько частичек вещества на поверхность
блока, очищая ее после каждого испытания. Записывают
температуру / , при которой вещество прекращает
мгновенно плавиться при соприкосновении с металлом.
Калибровка прибора. Для калибровки прибора
используют теА/пературу плавления таких веществ как,
например, стандартные вещества Всемирной Организации
Здравоохранения или другие подходящие вещества,
пригодные для этих целей.
Метод мгновенного плавления применяют для твердых
веществ, легко превращаемых в порошок.
2.2.17. ТЕМПЕРАТУРА
КАПЛЕПАДЕНИЯ
Температура каплепадения представляет собой температуру,
при которой в условиях, приведенных ниже,
первая капля расплавленного испытуемого вещества
падает из чашечки.
Прибор. Прибор (см. Рис. 2.2.17.-1) состоит из двух
металлических гильз /И/и (В), соединенных одна с дру-
гой посредством резьбы. Гильза (Al прикреплена к
ртутному термометру.
Рисунок 2.2.17.-1. Прибор для определения
температуры каплепадения
Размеры приведены в миллиметрах
В нижней части гильзы (BJ с помощью двух уплотнителей
(Ej свободно закреплена металлическая чашечка
(Fj Точное положение чашечки определяется фиксаторами
(D) длиной 2 мм, которые используются также
для центровки термометра. Отверстие (С) в стенке
гильзы (B] предназначено для выравнивания давления.
Отводящая поверхность чашечки должна быть плоской,
а края выходного отверстия - под прямым углом к
поверхности. Нижняя часть ртутного термометра имеет
форму и размер, указанные на рисунке; термометр
градуирован от О 0C до 1 Ю 0C и расстояние на шкале
в 1 мм соответствует разности температур в 1 °С.
Ртутный шарик термометра имеет диаметр
3.5 ± 0.2 мм и высоту 6.0 ± 0.3 мм.
Прибор устанавливают по оси пробирки длиной около
200 мм и наружным, диаметром, около 40 мм.
Прибор прикрепляют к пробирке с помощью пробки,
в которую вставлен термометр и которая имеет боковую
прорезь. Отверстие чашечки должно находиться
на расстоянии около 15 мм от дна пробирки. Все
устройство логружоют в стакан вместимостью около
1 л, заполненный водой. Дно пробирки должно находиться
на расстоянии около 25 мм от дна стакана.
Уровень воды должен достигать верхней части гильзы
(AJ. Для равномерного распределения температуры в
стакане используют мешалку.
Методика. Заполняют чашечку до краев нерасплавленным
испытуемым веществом при отсутствии других
указаний в частной статье. Избыток вещества удаляют
с обеих сторон шпателем. После того как гильзы
(AJ и /./соединены, проталкивают чашечку внутрь на
ее место в гильзе (BJ до упора. Удаляют шпателедл
вещество, выдавленное термометром. Прибор помещают
в водяную баню, как описано выше. Водяную
баню нагревают до температуры примерно на 10 0C
ниже предполагаемой температуры каплепадения и
устанавливают скорость нагрева около 1 0C в минуту.
Отмечают температуру падения первой капли.
Проводят не менее трех определений, каждый раз с
новым образцом вещества. Разность между показаниями
не должна превышать 3 0 C Среднее значение
из трех измерений является температурой каплепадения.
Определение температуры каплепадения проводят для
веществ, не растирающихся в порошок и плавящихся
ниже температуры кипения воды, таких как жиры, воск,
парафин, вазелин, смолы.
2.2.18. ТЕМПЕРАТУРА
ЗАТВЕРДЕВАНИЯ
Температура затвердевания представляет собой максимальную
температуру, при которой происходит затвердевание
переохлажденной жидкости.
Прибор. Прибор (см. Рис. 2.2.18-1) состоит из пробирки
для проведения испытания диаметром около
25 мм, и длиной около 150 мм, помещенной внутри
другой пробирки диаметром около 40 мм и длиной
около 100 мм. Внутренняя пробирка закрыта пробкой,
снабженной термометром длиной около 175 мм
с ценой деления 0.2 0C, который закреплен таким
образом, чтобы ртутный шарик находился на расстоянии
около 15 мм от дна пробирки. В пробке имеется
отверстие через которое проходит вал мешалки,
изготовленный из стеклянного стержня или другого
подходящего материала, согнутый на конце под прямым
углом в виде петли, внешний диаметр которой
около 18 мм. Внутреннюю пробирку вместе с внешней
пробиркой располагают в центре стакана вместимостью
1 л, содержащего подходящую охлаждаю-
щую жидкость, уровень которой находится в пределах
20 мм от верхнего края стакана. Охлаждающая
баня также должна быть снабжена термометром.
Методика. Во внутреннюю пробирку помещают
достаточное количество жидкости или предварительно
расплавленного испытуемого вещества, чтобы покрыть
ртутный шарик термометра, и при быстром охлаждении
определяют приблизительную температуру
затвердевания. Внутреннюю пробирку помещают в
водяную баню с температурой на 5 0C выше определенной
приблизительно температуры затвердевания
до полного расплавления кристаллов. Затем заполняют
стакан водой или насыщенным раствором натрия
хлорида с температурой на 5 0C ниже ожидаемой
температуры затвердевания. Внутреннюю пробирку
вместе с внешней помещают в стакан, тщательно перемешивают
содержимое до начала появления кристаллов
и выдерживают до полного затвердевания.
Отмечают наиболее высокую температуру, наблюдаемую
во время затвердевания.
Рисунок 2.2.18-].- Прибор для определения
температуры затвердевания
Размеры указаны в миллиметрах
Методика. Термометр укрепляют таким образом,
чтобы ртутный шарик находился посередине слоя испытуемого
вещества.
Температуру отмечают каждые 30 с. Вначале происходит
постепенное понижение температуры, затем, при
появлении твердой фазы, она остается некоторое
время постоянной или повышается перед тем, как стать
постоянной, а затем снова понижается. Отмечают
наиболее высокую температуру, остающуюся короткое
время постоянной с начала затвердевания вещества.
Если вещество остается жидким при ожидаемой температуре
затвердевания, то измерение проводят повторно
с внесением небольшого количества кристалликов
испытуемого вещества при температуре на
1 0C ниже ожидаемой температуры затвердевания.
2.2.19 АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ
ТИТРОВАНИЕ
При амперометрическом титровании конечную точку
определяют по изменению тока между погруженными
в испытуемый раствор электродами (один из них поляризующийся
индикаторный, а другой неполяризующий-
ся электрод сравнения, либо два поляризующихся индикаторных
электрода) как функции от количества
прибавленного титранта при постоянной и контролируемой
разности потенциалов. Потенциал индикаторного
электрода должен обеспечивать предельный диффузионный
ток для электрохимически активного соединения.
Прибор. Прибор состоит из источника постоянного
тока с регулируемым напряжением и чувствительного
микроамперметра. Детектирующая система обычно
состоит из индикаторного электрода (например, платинового,
ртутного капельного, вращающегося дискового
или графитового электрода) и электрода сравнения
(например, каломельного или хлорсеребряного
электрода).
Иногда используют трехэлектродную систему, состоящую
из индикаторного электрода, электрода сравнения
и поляризованного вспомогательного электрода.
Методика. Электроды помещают в анализируемый
раствор, устанавливают постоянный потенциал, указанный
в частной статье, и прибавляют титрант порциями.
По значениям силы начального тока и значениям,,
полученным в процессе титрования, строят гра-
фик зависимости силы тока от количества прибавляемого
титранта. Титрант прибавляют последовательно,
не менее чем тремя порциями, составляющими е
сумме 80 % от теоретического объема, соответствующего
предполагаемой точке эквивалентности. Три
полученных значения силы тока должны укладываться
на прямую. Продолжают последовательно прибавлять
титрант после предполагаемой точки эквивалентности
не менее трех раз. Полученные значения должны
укладываться на прямую. Точка пересечения этих двух
прямых представляет конечную точку титрования.
При амперометрическом титровании с двумя индикаторными
электродами регистрируют всю кривую титрования
и определяют конечную точку.
При амперометрическом титровании с двумя индикаторными
электродами (без электрода сравнения) оба
электрода выполнены из одного и того же материала
и имеют одинаковую относительно небольшую поверхность.
В этом случае регистрируют всю кривую титрования
и определяют конечную точку по минимальному
значению силы тока. Наибольшая точность ам-
перометрического титрования достигается при потенциале
на индикаторном электроде, соответствующем
предельному диффузионному току.
При амперометрическом титровании, как правило,
концентрация титранта в 10-20 раз превышает концентрацию
определяемого вещества.
Амперометрическое титрование с двумя индикаторными
электродами в фармакопейном анализе наиболее
часто применяется:
- при проведении йодометрического и нитритометри-
ческого титрования;
- при определении воды по методу К. Фишера.
В частных статьях следует указывать параметры, необходимые
для корректного воспроизведения методики,
например:типы электродов, задаваемый потенциал,
массу навески препарата, концентрацию титранта,
температуру и т.д.
2.2.20. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ
ТИТРОВАНИЕ
При потенциометрическом титровании конечную точку
титрования находят, измеряя электродвижущую силу
(ЭДС) электродной пары, состоящей из индикаторного
электрода и электрода сравнения или двух индикаторных
электродов, погруженных в испытуемый раствор,
как функцию количества прибавленного титранта.
ЭДС обычно измеряют при нулевом или практически
нулевом токе.
Прибор. Используемый прибор (простой потенциометр
или электронное устройство) включает вольтметр
с разрешением около милливольта.
Выбор индикаторного электрода зависит от природы
определяемого вещества. Этот электрод может быть
стеклянным или металлическим (например, платиновым,
золотым, серебряным или ртутным). Электродом
сравнения обычно служит каломельный или хлорсе-
ребряный электрод.
Для кислотно-основного титрования при отсутствии
других указаний в частной статье используют систему
стеклянного и каломельного или стеклянного и хлор-
серебряного электродов.
Методика. Строят график зависимости изменения
ЭДС от количества прибавленного титранта, продолжая
прибавлять титрант сверх предполагаемой точки
эквивалентности. Конечная точка соответствует резкому
изменению ЭДС.
Потенциометрическое титрование обычно дает более
точные результаты, чем индикаторное, особенно
при анализе мутных и окрашенных растворов, позволяет
автоматизировать процесс титрования.
Как правило, электродную пару погружают в испытуемый
раствор, кроме случаев, когда ионы из электрода
сравнения мешают титрованию. В этом случае электрод
сравнения соединяют с испытуемым раствором
электролитическим мостом.
Прибор. Измерение ЭДС производят при помощи
высокоомных потенциометров (рН-метров, иономет-
ров).
Потенциометрическое титрование применяют для
анализа, основанного на следующих типах реакций:
нейтрализации, осаждения, комплексообразования,
окисления-восстановления. Выбор электродов зависит
от типа аналитической реакции. Индикаторный
электрод выбирают так, чтобы его потенциал закономерно
изменялся при протекании химической реакции
между титруемыми ионами и ионами титранта
(табл.2.2.20.-1).
Таблица 2.2.20.-1
Электродные системы для потенциометрического титрования
Тип аналитической
реакции
Индикаторные
электроды
Электроды
сравнения
Применение
Кислотно-
основной
Стеклянный Хлорсеребряный,
каломельный
Титрование кислот, оснований и солей
Осаждения Серебряный,
сульфид-
серебряный
Хлорсеребряный,
каломельный,
стеклянный
Титрование галогенидов, роданидов,
цианидов, сульфидов
"Комлексо-
нометрический
Ртутный,
ионселективный
Хлорсеребряный,
каломельный,
стеклянный
Титрование катионов, образующих
прочные комплексонаты
Окислительно-
восстановительный
Платиновый Хлорсеребряный,
каломельный,
стеклянный
Титрование восстановителей различными
окислителями, например, броматом,
бихроматом, перманганатом, йодом
и церием (IV).
Титрование окислителей различными
восстановителями, например, арсенитом,
тиосульфатом и нитритом.
Методика. Объем титранта в точке эквивалентности
V может быть определен следующими способами:
1) по графику кривой титрования в координатах
[V; E]1 применяя метод касательных;
. E
2) по графику [V; /,
ZlK
где
. E- изменение ЭДС;
AV- соответствующее приращение объема титранта.
При этом точке эквивалентности соответствует макси-
AE
мальное значение ;
Эквивалентный объем титранта V рассчитывают по
формуле:
А
K= V1+(K-VJ —
А у - .
I 2
AV
3) расчетным путем по максимальному значени
где
V- объем титранта, соответствующий последнему
положительному (отрицательному) значению величины
..;
V0 - объем титранта, соответствующий первому отрицательному
(положительному) значению величины А ;
AE AE
Ау= А ( ) - приращения величин ·.
AV AV
При прохождении через точку эквивалентности А
меняет знак на противоположный.
AE
. . 0
AV
AE
и соответственно А ( /, как указано в Табл.
. V
2.2.20.-2 и формуле расчета.
Таблица 2.2.20.-2
V1, мл . V Е, мВ AE ..
AV
AE
..= .(-)
AV
5.00 250
13 130
5.10 263 + 150
0 1 28 280
5.20 291 +720
0.1 100 1000
5.30 391 -450
. 0.1 55 550
5.40 446 -330
0.1 22 220
5.50 468 -120
0.1 10 100
5.60 478
—
Пример:
Vm = 5.20 + (5.30-5.20)
720
= 5.26 мл
720 - (-450)
Потенциометрическое титрование может быть автоматизировано
путем применения приборов двух типов:
использующих математический анализ кривой
титрования или прекращающих прибавление титранта
при достижении ЭДС электродной пары, соответствующей
точке эквивалентности.
2.2.21. ФЛУОРИМЕТРИЯ
Флуорим>етрия - это метод, основанный на измерении
интенсивности флуоресценции испытуемого вещества
в сравнении с интенсивностью флуоресценции
соответствующего стандартного образца.
Методика. Испытуемое вещество растворяют в растворителе
или смеси растворителей, указанных в частной
статье. Полученный раствор переносят в кювету
флуориметра и воздействуют на него возбуждающим
излучением с длиной волны, близкой к монохроматическому
излучению, в соответствии с указаниями
в частной статье.
Интенсивность люминесцентного излучения измеряют
под углом 90 0 по отношению к возбуждающему излучению
после его прохождения через фильтр, пропускающий
излучение с длиной волны флуоресценции.
Допускается использование других типов приборов,
позволяющих получать идентичные результаты.
При количественных определениях первоначально устанавливают
нулевое значение на шкале прибора по
используемому растворителю или смеси растворителей,
а затем по стандартному раствору - показания
шкалы более 50. Если при установке показаний шкалы
изменилась ширина щели, то следует заново установить
нуль и повторно измерить интенсивность излучения
стандартного раствора. Затем кювету с испытуемым
раствором помещают в прибор и записывают
его показания. Концентрацию испытуемого
раствора (с ) рассчитывают по формуле:
с =
I- с
X S
I
где
с - концентрация стандартного раствора;
/ ~ интенсивность флуоресценции стандартного
раствора;
/ - интенсивность флуоресценции испытуемого
раствора.
При отсутствии прямой пропорциональной зависимости
интенсивности флуоресценции от концентрации
допускается определение концентрации по калибровочной
кривой. В некоторых случаях измерение мо-
жет быть проведено по известному стандартному образцу
(например, флуоресцирующее стекло или раствор
другого флуоресцирующего вещества). В таких
случаях концентрация испытуемого вещества должна
быть определена с использованием предварительно
полученной калибровочной кривой при тех же условиях.
2.2.22. АТОМНО-ЭМИССИОННАЯ
СПЕКТРОМЕТРИЯ
Атомно-эмиссионная спектрометрия - это м.етод определения
содержания химического элемента в испытуемом
образце посредством измерения интенсивности
одной из эмиссионных линий атомного пара элемента.
Определение проводят при длине волны, соответствующей
выбранной эмиссионной линии.
Прибор. Главными составными частями прибора являются:
генератор атомного пара определяемого элемента
(пламя, плазма, дуга и др.), монохроматор и
детектор. Если генератором атомного пара является
пламя, в качестве растворителя для приготовления
испытуемого и растворов сравнения предпочтительно
использовать воду Р. В качестве растворителя могут
также использоваться органические растворители,
если они не влияют на стабильность пламени.
Методика. Атомно-эмиссионный спектрометр выводят
на режим в соответствии с инструкцией завода-
производителя и устанавливают требуемую длину волны.
В генератор атомного пара вводят холостой раствор
и настраивают регистрирующее устройство на
нулевое значение. Вводят раствор сравнения определяемого
элемента с наибольшей концентрацией и
настраивают прибор так, чтобы получить регистрируемый
сигнал в оптимальном диапазоне измерений.
Определения проводят путем сравнения интенсивно-
стей эмиссии испытуемого раствора и растворов сравнения
с известными концентрациями определяемого
элемента способом калибровочной кривой (способ 1)
или способом стандартных добавок (способ 2).
СПОСОБ 1 - СПОСОБ КАЛИБРОВОЧНОЙ
КРИВОЙ
Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями
в частной статье. Не менее трёх растворов
сравнения определяемого элемента готовят так, чтобы
диапазон концентраций этих растворов включал
ожидаемое значение концентрации определяемого
элемента в испытуемом растворе. Любые реагенты,
используемые в приготовлении испытуемюго раствора,
прибавляют в растворы сравнения в таких же количествах,
как и в испытуемый раствор.
Испытуемый раствор и каждый раствор сравнения
вводят в генератор не менее трех раз и каждый раз
регистрируют установившееся показание. После ввода
испытуемого и растворов сравнения каждый раз
промывают прибор холостым раствором и проверяют,
чтобы показания регистрирующего устройства
возвращались до начального значения.
Строят калибровочную кривую зависимости средних
значений эмиссии растворов сравнения от концентрации
и определяют концентрацию элемента в испытуемом
растворе по построенной калибровочной кривой.
СПОСОБ 2 - СПОСОБ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК
Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями
в частной статье. Равные объемы испытуемого
раствора помещают не менее, чем в три мерные колбы
одинакового объёма. Во все колбы, кроме одной,
прибавляют пропорционально увеличивающиеся объемы
стандартного раствора определяемого элемента
и доводят содержимое каждой колбы растворителем
до метки. При этом значение эмиссии растворов со
стандартными добавками (растворов сравнения) должно
находиться в линейной области калибровочной
кривой. ·/>:.**-.
Испытуемый раствор и каждый раствор со стандартной
добавкой вводят в генератор не менее трех раз
и каждый раз регистрируют установившееся показание.
После ввода испытуемого раствора и растворов
с добавками каждый раз промывают прибор холостым
раствором и проверяют, чтобы показания регистрирующего
устройства возвращались до нулевого
значения.
Вычисляют параметры линейного уравнения прямой
зависимости средних значений эмиссии растворов от
концентрации методом наименьших квадратов, и
рассчитывают концентрацию определяемого элемента
в испытуемом растворе.
Допускается определение концентрации с использованием
графического метода. Для этого по оси ординат
откладывают средние значения эмиссии испытуемого
раствора и растворов со стандартными добавками,
а по оси абсцисс - концентрации стандартных
добавок определяемого элемента. Экстраполируют
линию, проходящую через полученные точки, до пересечения
с осью абсцисс. Концентрация определяемого
элемента в испытуемом растворе равна расстоянию
между полученной точкой и началом координат.
В случае использования техники ввода твердых проб,
условия проведения определений должны быть указаны
в частной статье.
2.2.23. АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ
СПЕКТРОМЕТРИЯ
Атомно-обсорбционная спектрометрия - это метод
определения содержания химического элемента в испытуемом
образце посредством измерения абсорбции
излучения атомным паром определяемого элемента.
Определение проводят при длине волны, соответствующей
выбранной абсорбционной линии.
Прибор. Главными составными частями прибора являются:
источник излучения, генератор атомного пара
определяемого элемента (пламя, печь и др.), моно-
хроматор и детектор.
Способ введения образца зависит от типо используемого
генератора. Если генератором атомного пара
является пламя, в качестве растворителя для приготовления
испытуемого и растворов сравнения предпочтительно
использовать воду Р. В качестве растворителя
могут также использоваться органические растворители,
если они не влияют на стабильность пламени.
При использовании печи образец может быть
введен в генерстор в виде раствора в воде P или
органическом, растворителе, также может быть применена
техника ввода твердых проб.
Атомный пар может быть получен также вне спектрометра,
например, методом холодного пара для определения
ртути или гидридным методом. При определении
ртути атомный пар, полученный химическим
восстановлением,, вносится потоком инертного газа в
абсорбционную ячейку, расположенную на оптическом
пути прибора. В случае использования гидридно-
го метода получают гидрид определяемого элемента,
который либо смешивается с газом, питающим горелку,
либо вносится инертным газом в нагретую абсорбционную
ячейку, где происходит диссоциация гидрида
до атомов.
Методика. Атомно-абсорбционный спектрометр выводят
на режим в соответствии с инструкцией завода-
производителя и устанавливают требуемую длину волны.
В генератор атомного пара вводят холостой раствор
и настраивают регистрирующее устройство на
максимальное светопропускание. Вводят раствор сравнения
определяемого элемента с наибольшей концентрацией
и настраивают прибор так, чтобы получить
регистрирующий сигнал в оптимальном диапазоне
измерений.
Определения проводят путем сравнения величины
поглощения испытуемого раствора и растворов сравнения
с известными концентрациями определяемого
элемента способом, калибровочной кривой (способ 1)
или способом стандартных добавок (способ 2).
СПОСОБ 1 - СПОСОБ КАЛИБРОВОЧНОЙ
КРИВОЙ
Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями
в частной статье. Не менее трёх растворов
сравнения определяемого элемента готовят так, чтобы
диапазон концентраций этих растворов включал
ожидаемое значение концентрации определяемого
элемента в испытуемом растворе. Любые реагенты,
используемые в приготовлении испытуемого раствора,
прибавляют в холостой и растворы сравнения в
таких же количествах, как и в испытуемый раствор.
Испытуемый раствор и каждый раствор сравнения
вводят в генератор не менее трех раз, и каждый раз
регистрируют установившееся показание. После ввода
испытуемого и растворов сравнения каждый раз
промывают прибор холостым раствором и проверяют,
чтобы показания регистрирующего устройства
возвращались до первоначального значения.
При использовании печи в качестве генератора атомного
пара между измерениями ее отжигают.
Строят калибровочную кривую зависимости средних
значений поглощения растворов сравнения от концентрации
и определяют концентрацию элемента по
значению поглощения испытуемого раствора по построенной
калибровочной кривой.
При использовании техники ввода твердых проб, условия
проведения определений должны быть указаны
в частной статье.
СПОСОБ 2 - СПОСОБ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК
Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями
в частной статье. Равные объемы испытуемого
раствора помещают не менее, чем в три мерные колбы
одинакового объёма. Во все колбы, кроме одной,
прибавляют пропорционально увеличивающиеся объемы
стандартного раствора определяемого элемента
и доводят содержимое каждой колбы растворителем
до метки. При этом значение поглощения растворов
со стандартными добавками (растворов сравнения)
должно находиться в линейной области калибровочной
кривой.
Испытуемый раствор и каждый раствор со стандартной
добавкой вводят в генератор не менее трех раз
и каждый раз регистрируют установившееся показание.
После ввода испытуемого раствора и растворов
с добавками каждый раз промывают прибор холостым
раствором и проверяют, чтобы показания регистрирующего
устройства возвращались до первоначального
значения.
При использовании печи в качестве генератора атомного
пара между измерениями её отжигают.
Вычисляют параметры линейного уравнения прямой
зависимости средних значений поглощения растворов
от концентрации методом наименьших квадра-
тов, и рассчитывают концентрацию определяемого
элемента в испытуемом растворе.
Допускается определение концентрации с использованием
графического метода. Для этого по оси ординат
откладывают средние значения поглощения испытуемого
раствора и растворов со стандартными добавками,
а по оси абсцисс - концентрации стандартных
добавок определяемого элемента. Экстраполируют
линию, проходящую через полученные точки, до
пересечения с осью абсцисс. Концентрация определяемого
элемента в испытуемом растворе равна расстоянию
между полученной точкой и началом координат.
При использовании техники ввода твердых проб, условия
проведения определений должны быть указаны
в частной статье.
Наряду с методами 1 и 2 допускается применение
метода сравнения и метода ограничивающих растворов,
а также других валидированных методов.
Общие требования к проведению атомно-
абсорбционного и атомно-эмиссионного анализа.
Для вычисления параметров линейного рабочего
участка калибровочных кривых целесообразно
как в методе 1, так и в методе 2 использовать метод
наименьших квадратов.
Последовательность введения испытуемого и растворов
сравнения в генератор должна быть указана при
необходимости в частной статье.
В методику атомно-абсорбционного (эмиссионного)
определения рекомендуется включать тест «Проверка
пригодности системы». Одним из параметров данного
теста является относительное стандартное отклонение
величины абсорбционного (эмиссионного)
сигнала, не превышающего значения, указанного в
частной статье.
В процессе проведения атомно-абсорбционных (эмиссионных)
определений целесообразно подтверждение
неизменности угла наклона линейного рабочего участка
калибровочной кривой.
Реактивы и стандартные растворы. Вода должна
быть деионизирована непосредственно перед употреблением
и должна соответствовать по чистоте воде
Р.
Ниже приведено приготовление растворов солей,
катионы которых наиболее часто нормируются в фармацевтическом
анализе.
Кальций. 1.001 г кальция карбоната Р, высушенного
до постоянной массы при температуре 105 0C, растворяют
в 25 мл I M кислоты хлороводородной и
доводят объем раствора водой P до 1.0 л. Раствор
содержит 400 мкг кальций-ионов в 1 мл.
Срок хранения раствора 1 мес, хранение при комнатной
температуре.
Калий. 1.1440 г калия хлорида Р, высушенного до
постоянной массы при температуре 130 0C, растворяют
в небольшом количестве воды P и доводят
объем раствора водой P до 1.0 л. Раствор содержит
600 мкг калий-ионов в 1 мл.
Срок хранения раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Натрий. 0.5084 г натрия хлорида Р, высушенного до
постоянной массы при температуре 130 0C, растворяют
в небольшом количестве воды P и доводят объем
раствора водой Pдо 1.0 л. Раствор содержит 200 мкг
натрий-ионов в 1 мл.
Срок хранения раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Цинк. 2.5 г цинка P растворяют в 20 мл 6 M раствора
кислоты хлороводородной и доводят объем раствора
водой P до 500.0 мл. Раствор содержит 5 мг цинк-
ионов в 1 мл.
Срок хранения раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Свинец. 0.1600 г свинца (II) нитрата P растворяют в
5 мл азотной кислоты P и доводят объем раствора
водой P до 1.0 л. Раствор свинца содержит 100 мкг
свинец-ионов в 1 мл.
Срок хранения раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Медь. 1.000 г меди /'растворяют в небольшом объеме
кислоты азотной P и доводят раствором 10 г/л
кислоты азотной P до 1.0 л. Раствор меди содержит
1 мг медь-ионов в 1 мл.
Срок хранения раствора 2 мес, хранение при комнатной
температуре.
Допускается использование других реактивов и стандартных
растворов для спектрального анализа, аттестованных
уполномоченным органом или признанных
им.
Стандартные и приготовленные на их основе растворы
сравнения хранят в плотно укупоренных контейнерах,
обеспечивающих постоянство концентрации этих
растворов (например, в контейнерах из кварца, тефлона
и т.п). Чашки и тигли для озоления проб должны
быть изготовлены из кварца.
2.2.24. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРО-
ФОТОМЕТРИЯ В ИНФРАКРАСНОЙ
ОБЛАСТИ
Инфракрасные спектрофотометры применяют для
записи спектров в области от 4000 см'' до 650 см '
(от 2.5 мкм до 15 мкм), а в некоторых случаях до
200 см"'1 (до 50 мкм).
АППАРАТУРА
Спектрофотометры для записи спектров состоят из
подходящего источника света, монохроматора или
интерферометра и детектора.
В спектрофотометрах с Фурье-преобразованием используют
полихроматическое излучение и рассчитывают
спектр в заданной области частот путем Фурье-
преобразования исходных данных. Допускается использование
спектрофотометров, снабженных оптической
системой, способной выделять монохроматическое
излучение в измеряемой области. Обычно спектр представляют
как функцию пропускания, то есть отношения
интенсивностей прошедшего и падающего излучения.
Допускается представление спектра в величинах
оптической плотности.
Оптическую плотность (D) определяют как десятичный
логарифм обратной величины пропускания (Tj :
P = I o 9 1 0 ( I / / - ) - l o g i 0 ( / , / / ),
где
I0 - интенсивность излучения, падающего на вещество;
/-интенсивность излучения, прошедшего через вещество.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА
Для записи пропускания или поглощения субстанцию
готовят по одной из следующих методик.
Жидкости. Жидкости исследуют или в форме пленки
между двумя пластинками, прозрачными для инфракрасного
излучения, или в кювете с соответствующей
толщиной слоя, также прозрачной для инфракрасного
излучения.
Жидкости или твердые вещества в растворе.
Готовят раствор испытуемой субстанции в подходящем
растворителе. Выбирают концентрацию вещества
и толщину слоя кюветы, позволяющие получить
удовлетворительный спектр. Обычно хорошие результаты
получают при концентрациях от 10 г/л до
100 г/л при толщине слоя от 0.5 мм до 0.1 мм. Поглощение
растворителя компенсируют путем помещения
в канал сравнения аналогичной кюветы, содержащей
выбранный растворитель. При использовании
прибора ИК-ФП поглощение излучения компенсируют
путем последовательной записи спектров растворителя
и испытуемого образца. Поглощение излучения
растворителем, скорректированное компенсационным
коэффициентом, вычитают с помощью расчетной
программы.
Твердые вещества. Твердые вещества исследуют
диспергированными в подходящей жидкости в виде
суспензии или в твердом состоянии (диски из галоге-
нидов щелочных металлов). Если указано в частной
статье, формируют пленку из расплавленной массы
между двумя пластинами, прозрачными для инфракрасного
излучения.
A. Суспензия. Небольшое количество субстанции,
предназначенной для испытания, растирают с минимальным
количеством вазелинового масла Р\ЛП\Л другой
подходящей жидкости; обычно от 5 мг до 10 мг
субстанции достаточно для получения подходящей
суспензии с использованием 1 капли вазелинового
масла Р. Полученную суспензию сжимают между двумя
пластинками, прозрачными для инфракрасного
излучения.
B. Диски. При отсутствии других указаний от 1мг до
2 мг субстанции растирают с 300-400 мг тонко измельченного
и высушенного калия бромида P или
калия хлорида Р. Обычно этих количеств достаточно
для получения диска диаметром 10-15 мм и спектра
соответствующей интенсивности. Если вещество является
гидрохлоридом рекомендуют использовать калия
хлорид Р. Смесь тщательно перетирают, добиваясь
необходимой однородности, и прессуют при давлении
около 800 МПа (8 т-см'2). Для гигроскопичных или
неустойчивых при обычных условиях веществ диски
прессуют в вакууме. Причиной образования некачественных
дисков могут быть такие факторы, как недостаточное
или чрезмерное растирание, влажность или
иные примеси в дисперсионной среде и недостаточное
измельчение частиц.
Диск непригоден для испытания, если он при визуальном
осмотре неоднороден по прозрачности или если
пропускание при 2000 см"' (5 мкм) составляет менее
60 % без компенсации при отсутствии специфической
полосы поглощения вещества.
Газы. Газы исследуют в кювете, прозрачной для инфракрасного
излучения с длиной оптического пути около
100 мм. Из кюветы откачивают воздух, заполняют
ее необходимым газом до требуемого давления при
помощи крана или игольчатого клапана через подходящую
газовую линию между кюветой и контейнером
с субстанцией, предназначенной для испытания.
При необходимости доводят давление в кювете до
атмосферного, используя газ, прозрачный для инфракрасного
излучения (например, азот P или аргон P).
Отрицательное влияние поглощения воды, углерода
диоксида или других атмосферных газов исключают
путем помещения в канал сравнения идентичной кюветы,
которая либо вакуумирована, либо заполнена
газом, прозрачным для инфракрасного излучения,
ЗАПИСЬ МНОГОКРАТНОГО ОТРАЖЕНИЯ
Твердые вещества. Смесь субстанции с тонко измельченным
и высушенным калия бромидом P или
калия хлоридом P тщательно растирают в порошок .
При отсутствии других указаний используют смесь,
содержащую приблизительно 5 % субстанции. Смесь
измельчают, помещают в емкость для пробы и исследуют
спектр отражения.
Спектр образца в единицах измерения оптической
плотности получают после его математической обработки
с помощью функции Кубелка-Мунк.
ЗАПИСЬ ЗАТУХАЮЩЕГО ОБЩЕГО ОТРАЖЕНИЯ
Затухающее общее отражение (включая многократное
отражение) содержит свет, отраженный внутри
пропускающей среды и представляющий собой сумму
отражений. Существует несколько способов получения
только одного отражения. Для этого испытуемую
субстанцию помещают вместе с элементом внутреннего
отражения (ЭВО) таким, как например, алмаз,
германий, цинка селенид, таллия бромид - таллия
йодид (KRS-5) или другим подходящим материалом
с высоким показателем преломления. Близкий и
однородный контакт между субстанцией и всей поверхностью
кристалла элемента внутреннего отражения
обеспечивают либо приложением давления, либо
растворением субстанции в подходящем растворителе.
Затем ЭВО покрывают полученным раствором и
выпаривают досуха. Исследуют спектр затухающего
общего отражения (ЗОО).
ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ
Образцы испытуемой субстанции и стандартного вещества
готовят по одной и той же методике и записывают
спектры в области от 4000 см'1 до 650 см"1 (от
2.5 мкм до 15.4 мкм) в одинаковых условиях. Минимумы
пропускания (максимумы поглощения) в спектрах
испытуемой субстанции должны соответствовать
по положению и относительной величине таковым в
спектре стандартного образца.
Если спектры, полученные в твердом состоянии, показывают
различия в положении минимумов пропускания
(максимумов поглощения), то образец испытуемой
субстанции и стандартный образец обрабатывают
одним и тем же способом так, чтобы они кристаллизовались
или получались в одной и той же форме,
или обрабатывают способом, указанным в частной
статье, а затем снимают спектры.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
СТАНДАРТНЫХ СПЕКТРОВ
Контроль разрешающей способности Записывают
спектр пленки полистирола толщиной примерно
35 мкм. Разность А-(см. Рис. 2.2.24.-1) между процентом
пропускания при максимуме пропускания А при
2870 см"1 (3.48 мкм) и минимуме пропускания В при
2849.5 см"' (3.51 мкм) должна быть более 18. Разность
у между процентом пропускания при максимуме
пропускания Спри 1589 см"' (6.29 мкм) и минимуме
пропускания D при 1583 см"' (6.32 мкм) должна
быть более 10.
pl . и . Ol
3200 3000 2800 2600 1S00 1600
Волновое число, см"'
Рисунок 2.2.24.-1 Типичный спектр полистирола,
используемого для проверки разрешающей
способности
Для спектрофотометров с Фурье-преобразованием
используют прибор с соответствующим разрешением,
описанным производителем. Преобразование
проверяют подходящими методами, например, путем
записи спектра полистирольной пленки толщиной приблизительно
35 мкм. Разность между поглощением при
минимуме поглощения 2870 см 1 и максимумом поглощения
при 2849.5 см'1 должно быть более 0.33. Разность
между поглощениями при минимуме поглощения
1589 см"1 и максимумом поглощения при 1583 см'1
должно быть более 0.08.
Проверка шкалы волновых чисел Шкала волновых
чисел может быть проверена с использованием
пленки полистирола, которая имеет минимум пропускания
(максимум поглощения) при волновых числах
(см ' ) , приведенных в Табл. 2.2.24.-1.
Таблица 2.2.24.-1
Минимумы пропускания и допустимые пределы
пленки полистирола
Минимум
поглощения
(СМ"')
Допустимые пределы (см') Монохроматор Прибор с Фурье-
преобразованием
3060.0 ± 1.5 ± 1.0
2849.5 ± 2.0 ± 1.0
1942.9 ± 1.5 + 1.0
1601.2 ± 1.0 ± 1.0
1583.0 ± 1.0 ± 1.0
1154.5 ± 1.0 ± 1.0
1028.3 ± 1.0 ± 1.0
Методика. Субстанцию готовят к испытанию согласно
инструкции, приложенной к стандартному спектру/
стандартному веществу. Используя условия, при
которых проводилась проверки разрешающей способности
и получен стандартный спектр, записывают
спектр испытуемой субстанции. Положение и относительная
величина полос поглощения спектра испытуемой
субстанции и стандартного спектра должны
согласовываться между собой.
Компенсация паров воды и атмосферного углерода
диоксида. При использовании прибора с
Фурье-преобразованием помехи в спектрах, вызываемые
парами воды и углерода диоксида, компенсируют
по алгоритму в соответствии с инструкциями производителя.
В качестве альтернативы допускается получение
спектров на приборах, очищенных соответствующим
образом или наличием гарантии того, что
спектры образца и фона записаны в совершенно
одинаковых условиях.
ПРИМЕСИ В ГАЗАХ
Для анализа примесей используют кювету, прозрачную
для инфракрасного излучения и имеющую соответствующую
длину оптического пути (например, от
1 м до 20 м). Кювету заполняют в соответствии с указаниями
в разделе «Газы». Для определения и количественной
оценки примесей используют методики,
указанные в частных статьях.
Спектрофотометрию в ИК-области спектра используют
для подтверждения подлинности, для контроля посторонних
примесей в субстанциях и в ряде случаев
для количественного определения.
2.2.25. АБСОРБЦИОННАЯ
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ
И ВИДИМОЙ ОБЛАСТЯХ
Определение оптической плотности Оптическая
плотность (D) раствора представляет собой десятичный
логарифм обратной величины пропускания (T)
для монохроматического излучения и выражается соотношением:
/ ? = 1 о д 1 0 ( 1 / Т ) =1од1 0 ( / , / / )
.- I0H
где
/ - интенсивность падающего монохроматического
излучения;
/ - интенсивность прошедшего монохроматического
излучения.
В отсутствии других физико-химических факторов измеренная
оптическая плотность /©/пропорциональна
длине пути (Ь), через который проходит излучение, и
концентрации (с) вещества в растворе в соответствии
с уравнением:
D=e-c-b,
где
. — молярный показатель поглощения;
b - длина оптического пути в сантиметрах;
с - концентрация вещества в растворе в молях на
литр.
Величина E представляет собой удельный показа-
1 см
тель поглощения, т.е. оптическую плотность раствора
вещества с концентрацией 10 г/л в кювете с толщиной
слоя 1 см, т.е.:
10- .
[см
Mr
При отсутствии других указаний в частной статье измерение
оптической плотности проводят при указанной
длине волны с использованием кюветы длиной
1 см и при температуре 20 ± 1 0C. При отсутствии
других указаний в частной статье измерение проводят
по сравнению с тем же растворителем или той же
смесью растворителей, в которой растворено вещество.
Оптическая плотность растворителя, измеренная
против воздуха при указанной длине волны, не
должна превышать 0.4 и желательно, чтобы она была
меньше 0.2. Спектр поглощения представляют таким
образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая
функция были приведены по оси ординат, а длина
волны или некоторая функция от длины волны - по оси
абсцисс.
Бели в частной статье приводят только одно значение
для положения максимума поглощения, то это означает,
что полученное значение максимума не должно
отличаться от указанного более чем на ± 2 нм.
Прибор. Спектрофотометр, предназначенный для
измерений в ультрафиолетовой и видимой областях
спектра, состоит из оптической системы, выделяющей
монохроматическое излучение в области от 200 нм
до 800 нм, и устройства для измерения оптической
плотности.
Проверка шкалы длин волн. Для проверки шкалы
длин волн используют линии водородной или дейте-
риевой разрядной лампы или линии паров ртути, а
также максимумы поглощения раствора гольмия перхлората
Р, которые представлены в Таблице 2.2.25.-1.
Допустимое отклонение составляет ± 1 нм для ультрафиолетового
и ± 3 нм для видимого диапазонов.
Таблица 2.2.25.-1
Максимумы поглощения (или испускания) для проверки
шкалы длин волн
241.15 нм (Но) 404.66 нм (Hg)
253.7 нм (Hg) 435.83 нм (Hg)
287.15 нм (Но) 486.0 нм (Dp)
302.25 нм (Hg) 486.1 нм (..)
313.16 нм (Hg) 536,3 нм (Но)
334.15 нм (Hg) 546.07 нм (Hg)
361.5 нм (Но) 576.96 нм (Hg)
365.48 нм (Hg) 579.07 нм (Hg)
Проверка шкалы оптической плотности. Проверяют
значения оптических плотностей, используя
подходящий фильтр или раствор калия дихромата P
при длинах волн, указанных в Табл. 2.2.25.-2. В Табл.
2.2.25.-2 приведены точные значения удельного показателя
поглощения и его допустимые пределы для каждой
длины волны. Допустимые пределы значений оптической
плотности ± 0.01.
Для проверки шкалы оптических плотностей используют
раствор калия дихромата, приготовленный следующим
образом. От 57.0 мг до 63.0 мг (точную навеску)
калия дихромата P1 предварительно высушенного
до постоянной массы при тем.пературе 130 0C,
растворяют в 0.005 M растворе кислоты серной и
доводят до 1.0 л этим же растворителем.
Таблица 2.2.25.-2
Длина
волны, в
нанометрах
Удельный
показатель
поглощения
I си
Допустимые
пределы
I см
235 124.5 от 122.9
до 126.2
257 144.5 от 142.8
до 146.2
313 48.6 от 47.0
до 50.3
'350 107.3 от 105.6
до 109.0
Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный
свет может быть определен при данной длине
волны с использованием соответствующих фильтров
или растворов: например, оптическая плотность
раствора 12 г/л калия хлорида P B кювете с толщиной
слоя 1 см при 200 нм при использовании воды P
в качестве компенсационного раствора должна быть
больше 2.
Разрешающая способность (для качественного
анализа). Если указано в частных статьях, то определяют
разрешающую способность спектрофотометра
следующим образом. Записывают спектр
0.02 % (об/об) раствора толуола P в геьсане Р.
Минимально допустимое значение отношения оптической
плотности в максимуме поглощения при 269 нм
к оптической плотности в минимуме поглощения при
266 нм указывают в частной статье.
Ширина спектральной щели (для количественного
анализа). В случае использования спектрофотометра
с изменяемой шириной спектральной щели
при выбранной длине волны возможны погрешности,
связанные с шириной этой щели. Для их исключения
ширина спектральной щели должна быть малой по
сравнению с полушириной полосы поглощения и в то
же время должна быть максимально велика для получения
высокого уровня / Таким образом, ширина щели
должна быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение
не изменяло величину измеряемой оптической
плотности.
Кюветы. Допустимые вариации в толщине слоя используемых
кювет должны быть не более ± 0.005 см.
Кюветы, предназначенные для испытуемого и компенсационного
растворов, должны иметь одинаковое
пропускание (или оптическую плотность) при заполнении
одним и тем же растворителем. В противном
случае это различие следует учитывать.
Кюветы должны быть чистыми и требуют осторожного
обращения.
ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
В производной спектрофотометрии используется преобразование
исходного спектра поглощения (нулевой
порядок) в производные спектры первого, второго и
более высоких порядков.
Производный спектр первого порядка представляет
собой график зависимости градиента кривой
поглощения (скорость изменения оптической плотности
с длиной волны, aD/..) от длины волны.
Производный спектр второго порядка представляет
собой график зависимости кривизны спектра
поглощения от длины волны (d2D/dX7). Вторая производная
при любой длине волны I связана с концентрацией
следующим соотношением:
..2 dX2
с Ь d . cb
10 dk2 10
где
с - концентрация поглощающего раствора в граммах
на литр.
Прибор. Используют спектрофотометр, отвечающий
указанным выше требованиям и оснащенный аналоговым
резистентно-емкостным дифференцирующим
модулем или цифровым дифференциатором, или другими
средствами получения производных спектров.
Некоторые методы получения производных спектров
второго порядка сдвигают их относительно спектра
нулевого порядка, что следует учитывать там, где это
необходимо.
Разрешающая способность. Если указано в частных
статьях, записывают производный спектр второго
порядка для раствора 0.2 г/л толуола PB метаноле
Р, используя метанол PB качестве компенсационного
раствора. На спектре должен присутствовать
небольшой отрицательный экстремум, расположенный
между двумя большими отрицательными экстремумами
при 261 нм и 268 нм соответственно, как показано
на Рис. 2.2.25.-1. При отсутствии других указаний
в частных статьях, отношение А/В (см. Рис. 2.2.25.-1)
должно быть не менее 0.2.
Методика. Готовят раствор испытуемого вещества,
устанавливают различные инструментальные характеристики
в соответствии с инструкцией к прибору и
рассчитывают количество определяемого вещества в
соответствии с указаниями в частной статье.
d2/VdX2
Рисунок 2.2.25.-1
Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой
и видимой областях используется для определения
следующих показателей качества: подлинность,
сеетопоглощающие примеси, однородность дозирования,
растворение, количественное определение.
Спектрофотометрический анализ по непосредственному
измерению оптической плотности может быть
проведен для веществ, обладающих лишь определенными
особенностями строения (ароматические соединения,
соединения с сопряженными кратными связями,
соединения ряда металлов и др.). Некоторые анализируемые
вещества необходимо предварительно
перевести в соединение, поглощающее излучение.
Спектрофотометрические измерения чаще проводят
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Количественное определение проводится способом
показателя поглощения, способом сравнения с раствором
стандартного образца и способом определения
по градуировочному (калибровочному графику)
в координатах «оптическая плотность-концентрация»,
построенному с использованием серии стандартных
образцов.
При способе показателя поглощения измеряют оптическую
плотность (D) раствора испытуемого образца
при аналитической длине волны и расчет концентрации
(С) производят на основании известного значения
удельного показателя поглощения (E 1 % ) :
1 см
D
С =
Е , %
1 см
E 1" - удельный показатель поглощения представляет
собой оптическую плотность раствора, содержащего
1 г стандартного вещества в 100 мл раствора при
толщине слоя 1 см.
При способе сравнения с раствором стандартного
образца измеряют оптические плотности раствора
испытуемого образца (D) и раствора стандартного
образца (D ) с концентрацией Cn и расчет концентрации
(С) испытуемого образца производят исходя из
формулы:
С D
C0 D0
Измерение оптических плотностей испытуемого раствора
и раствора сравнения следует проводить в
одних и тех же условиях с минимальным интервалом
во времени. Более часто используется способ сравнения
с раствором стандартного образца, так как
этот способ более точен, позволяет использовать
приборы различного класса точности.
Способ показателя поглощения обычно применим
при допусках содержания определяемого компонента
не менее ± 10 % от номинального содержания. Во
всех случаях применения однокодлпонентного анализа
необходимо, чтобы остальные компоненты препарата
не оказывали существенного влияния на результаты.
Для одновременного количественного определения
компонентов лекарственных средств применяют многокомпонентный
спектрофотометрический анализ.
Выделение аналитических полос для каждого отдельного
компонента становится затруднительным, поэто-
для растворов, хотя такие измерения могут быть проведены
и для веществ, находящихся в парообразном,
жидком и твердом состояниях.
Испытуемый образец вещества при спектрофотомет-
рических определениях обычно растворяют в соответствующем
растворителе. Для определения пригодны
многие растворители, в том числе вода, спирты,
хлороформ, низшие углеводороды, эфиры, разбавленные
растворы аммиака, натрия гидроксида, хлороводородной
или серной кислот. Следует использовать
растворители, не содержащие примеси, поглощающие
в данной спектральной области.
Определения, связанные с измерением поглощения
электромагнитного излучения основаны на законе
Бугера-Ламберта и законе Бера.
Закон Бугера-Ламберта связывает поглощение с толщиной
слоя (Ь) раствора испытуемого вещества, закон
Беро связывает поглощение с концентрацией испытуемого
вещества (С) в растворе. На практике используется
объединенный закон Бугера-Ламберта-
Бера в виде:
Ig - = ..>,
I
где
In
- интенсивность падающего монохроматического
излучения;
I - интенсивность прошедшего монохроматического
излучения;
X ~ показатель поглощения.
Величина Ig (10/1) носит название оптической плотности
и обозначается буквой D.
му количественные определения могут быть произведены
путем измерения оптической плотности при нескольких
значениях длин волн и решения системы линейных
уравнений, связывающих суммарную величину
оптической плотности смеси при данной длине волны
с величиной оптической плотности для каждого индивидуального
компонента.
Количественное определение в многокомпонентном
спектрофотометрическом анализе основывается обычно
на использовании уравнения:
m
D = I E x C , . = 1....П,
i=i
D - оптическая плотность испытуемого раствора при
i-ой длине волны;
E - показатели поглощения (зависящие от способа
выражения концентрации) j -ого компонента испытуемого
образца при i-ой аналитической длине волны;
С ~ концентрация j -ого компонента испытуемого
образца.
Погрешность анализа спектрофотометрических определений
индивидуальных соединений обычно не превышает
1 %, при многокомпонентном спектрофотометрическом
анализе ошибка определения возрастает.
Поэтому прогноз погрешности определения и
сравнение ее с допусками содержания анализируемого
компонента является обязательным условием при
обосновании применимости методик многокомпонентной
спектрофотометрии.
2.2.26. ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ
ВОСХОДЯЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ
Оборудование. Оборудование состоит из стеклянной
камеры с плотно закрывающейся крышкой. В верхней
части камеры имеется специальное устройство,
удерживающее в подвешенном состоянии хроматог-
рафическую бумагу и способное опускать ее при закрытой
камере. На дно камеры помещают лодочку с
подвижной фазой, в которую опускают конец бумаги.
Хроматографическую бумагу разрезают в направлении
ее текстуры на полосы достаточной длины и шириной
не менее 25 см.
Методика. Лодочку заполняют подвижной фазой до
образования слоя глубиной 2.5 см. В соответствии с
указаниями в частной статье внутренние стенки камеры
выстилают фильтровальной бумагой, импрегни-
рованной подвижной фазой. Для насыщения камеру
закрывают и выдерживают в течение 24 ч при температуре
от 20 °С до 25 0C Камеру термостатируют
при данной температуре в течение всего испытания.
Отступив от края 3 см, на хроматографической бумаге
карандашом проводят горизонтальную линию (линия
старта), на которую микропипеткой наносят раствор
в соответствии с описанием в частной статье.
Поскольку диаметр пятна не должен превышать
10 мм, большой объем раствора наносят в несколько
приемов, позволяя каждой порции высохнуть перед
следующим нанесением. При совместном хрома-
тографировании нескольких растворов расстояние
между пятнами на линии старта должно быть не менее
3 см. Бумагу помещают в камеру, последнюю
закрывают крышкой и выдерживают в течение 1 ч
30 мин. Затем конец полосы бумаги опускают в подвижную
фазу таким образом, чтобы она не касалась
нанесенного пятна. Хроматографируют в течение времени
или до расстояния, указанным в частной статье.
Бумагу вынимают из камеры, сушат на воздухе. Хроматографическую
бумагу защищают от яркого света
в течение всего процесса разделения.
НИСХОДЯЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ
Оборудование. Оборудование состоит из стеклянной
камеры с плотно закрывающейся крышкой. В центре
крышки должно быть отверстие диаметром около
1.5 см, закрытое тяжелой стеклянной пластиной
или пробкой. В верхней части камеры подвешивают
лодочку для растворителя. На каждой стороне лодочки
параллельно и чуть выше ее верхних краев устанавливают
два стеклянных регулирующих стержня,
удерживающих бумагу таким образом, чтобы она не
соприкасалась со стенками камеры. Хроматографическую
бумагу разрезают в направлении ее текстуры
на полосы достаточной длины и шириной не менее
25 см и не более длины лодочки.
Методика. В камеру наливают растворитель до
образования слоя глубиной 2.5 см, закрывают крышкой
и выдерживают в течение 24 ч при температуре
от 20 0C до 25 0 C Камеру термостатируют при данной
температуре в течение всего испытания. Карандашом
проводят линию старта на одном конце бумаги,
отступив от ее края на такое расстояние, чтобы
линия находилась на несколько сантиметров выше
регулирующего стержня и была параллельна ему
после закрепления конца бумаги в лодочке. Остальная
часть листа бумаги должна свободно свисать над
регулирующим стержнем. Бумагу помещают в камеру,
последнюю закрывают крышкой и выдерживают в
течение 1 ч 30 мин. Затем через отверстие в крышке
заполняют лодочку растворителем, закрывают отверстие
и хроматографируют в течение времени или до
расстояния, указанного в частной статье. Бумагу вынимают
из камеры и сушат на воздухе. В процессе
разделения хроматографическую бумагу защищают
от яркого света.
2.2.27. ТОНКОСЛОЙНАЯ
ХРОМАТОГРФИЯ
Тонкослойная хроматография представляет собой
метод разделения, в котором используется неподвижная
фаза, состоящая из подходящего материала, нанесенного
в виде стандартизованного тонкого слоя и
зафиксированного на подложке (пластинке или пластине)
из стекла, металла или пластмассы. Перед хро-
матографированием растворы анализируемых веществ
наносят на пластинку. Разделение основано на процессах
адсорбции, распределения, ионного обмена
или на их комбинации и осуществляется посредством
перемещения в тонком слое (неподвижной фазе) исследуемых
веществ, растворенных в растворителе или
соответствующей смеси растворителей (подвижной
фазе).
ОБОРУДОВАНИЕ
Пластинки. Хроматографирование проводят с использованием
пластинок, полученных в соответствии
с описанием в разделе 4.1. I. «Реактивы».
Предварительная подготовка пластинок
При необходимости перед использованием пластинки
либо промывают путем хроматографирования в
подходящем растворителе, либо импрегнируют посредством
элюирования, погружения или опрыскивания,
либо активируют в термостате при температуре от
100 0C до 105 0C в течение 1 ч.
Хроматографическая камера представляет собой
емкость с плотно подогнанной крышкой и плоским
дном или дном с двумя желобами из инертного
прозрачного материала, соответствующими по размеру
используемым пластинкам. Для горизонтального
элюирования хроматографическая камера имеет желоб
для подвижной фазы и дополнительно содержит
устройство для подачи подвижной фазы к неподвижной
фазе.
Микропипетки, микрошприцы, калиброванные
капилляры или другие устройства, пригодные
для нанесения растворов.
Устройство для обнаружения или гашения флуоресценции
Проявляющие реактивы применяют для обнаружения
разделенных веществ посредством опрыскивания,
обработки парами или погружения.
Вертикальное элюирование. Стенки хроматогра-
фической камеры выстилают фильтровальной бумагой.
Подвижную фазу наливают в камеру в количестве,
достаточном и для импрегнирования фильтровальной
бумаги, и для хроматографирования. Для насыщения
хроматографическую камеру с подвижной
фазой закрывают крышкой и выдерживают в течение
1 ч при температуре от 20 0C до 25 0C
Объемы растворов анализируемых веществ, указанные
в частной статье, наносят небольшими порциями
в виде полос или круглых пятен на линию, параллельную
нижнему краю пластинки, отступая на необходимое
расстояние от ее боковых краев. Расстояние
между точками нанесения проб должно быть не менее
10 мм.
После испарения растворителей из нанесенных проб
пластинку помещают в хроматографическую камеру,
по возможности, вертикально. При этом линия старта
с нанесенными пятнами или полосами должна быть.
выше уровня подвижной фазы. Камеру закрывают, оставляют
ее при температуре от 20 °С до 25 0C в
защищенном от прямых солнечных лучей месте. После
прохождения подвижной фазой расстояния, указанного
в частной статье, пластинку вынимают, сушат
и проявляют пятна способом, указанным в частной
статье.
В случае двумерной хромотографии пластинку сначала
хроматографируют в одном направлении, а затем
после высушивания - во втором направлении, перпендикулярном
первому.
Горизонтальное элюирование. Объемы растворов
анализируемых веществ, указанные в частной
статье, наносят небольшими порциями на линию, параллельную
нижнему краю пластинки, в виде круглых
пятен (диаметр от 1 мм до 2 мм) или полос (длина от
5 мм до 10 мм и ширина от 1 мм до 2 мм), отступая на
необходимое расстояние от боковых краев пластинки.
Расстояние между точками нанесения проб должно
быть не менее 5 мм.
После испарения растворителей из нанесенных проб
в желоб хроматографической камеры вводят с помощью
шприца или пипетки достаточное количество
подвижной фазы, помещают пластинку горизонтально
в хроматографическую камеру и подсоединяют
устройство для подачи подвижной фазы в соответствии
с инструкцией производителя. Если указано в
частной статье, пластинку элюируют, начиная одновременно
с двух концов. Камеру закрывают и проводят
хроматографирование при температуре от 20 0C
до 25 0O После прохождения подвижной фазой расстояния,
указанного в частной статье, пластинку вынимают,
сушат и проявляют пятна указанным способом.
В случае двумерной хроматографии пластинку сначала
хроматографируют в одном направлении, а затем
после высушивания - во втором направлении, перпендикулярном
первому.
ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА
Идентификация. Основное пятно на хроматограм-
ме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают
визуально с соответствующим пятном на хрома-
тограмме, полученной для раствора стандартного
образца (раствора сравнения), сравнивая окраску
(цвет флюоресценции), размер и относительную величину
удерживания (RJ обоих пятен.
Относительную величину удерживания (RJ определяют
как отношение расстояния отточки нанесения пятна
до центра пятна после хроматографироваиия к расстоянию,
пройденному фронтом растворителя от точки
нанесения.
Проверка разделяющей способности неподвижной
фазы для идентификации. Обычно для оценки пригодности
достаточно испытания на пригодность неподвижной
фазы, описанного в разделе 4.1.1. «Реактивы
». В особых случаях дополнительные требования
указывают в частных статьях.
Испытание на родственные примеси. Дополнительное
пятно (пятна) на хроматограмме, полученной
для испытуемого раствора, сравнивают визуально с
соответствующим пятном (пятнами) на хроматограмме,
полученной для раствора сравнения. В качестве
стандартного образца для приготовления раствора
сравнения используют как саму примесь (примеси),
так и различные разбавления испытуемого раствора.
Проверка разделяющей способности. Требования для
проверки разделяющей способности приводят в соответствующих
частных статьях.
Проверка чувствительности. Чувствительность считается
удовлетворительной, если пятно или полоса четко
видны на хроматограмме наиболее разбавленного
раствора сравнения.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ
Требования к разрешению и разделению приводят в
частных статьях.
В том случае, когда вещества, разделяемые методом
тонкослойной хроматографии, поглощают или флуоресцируют
в ультрафиолетовом или видимом свете,
их можно количественно определить непосредственно
на пластинке, используя подходящее оборудование.
Для этого измеряют отражение или пропускание
падающего света, передвигая пластинку или измеряющее
устройство. Аналогичным образом, используя
подходящее оптическое оборудование, можно измерять
флуоресценцию. Вещества, содержащие радионуклиды,
могут быть количественно определены тремя
способами:
- непосредственно на пластинке, путем перемещения
ее вдоль подходящего счетчика радиоактивности или
наоборот счетчика радиоактивности вдоль пластины
(см. Радиофармацевтические препараты 125/'
- разрезают пластинки на полосы и измеряют радиоактивность
на каждой полосе, используя подходящий
счетчик радиоактивности;
- соскребают с пластинки неподвижную фазу, растворяют
ее в подходящем сцинтилляционном коктейле и
измеряют радиоактивность, используя жидкостный
сцинтилляционный счетчик.
Оборудование. Оборудование для измерений непосредственно
на пластинке включает в себя:
- устройство для прямого нанесения в определенном
месте пластинки необходимого количества вещества;
- механическое устройство для передвижения пластинки
или измерительного устройства вдоль осей
X или У;
- самописец и интегратор или компьютер;
- для веществ, поглощающих или флуоресцирующих
в ультрафиолетовом или видимом свете: для
измерения отражения или пропускания используются
фотометр с источником света, оптическое устройство,
генерирующее монохроматический свет,
и фотоячейку соответствующей чувствительности; в
том случае, когда измеряется флуоресценция, требуется
дополнительно монохроматический фильтр
для выбора соответствующей спектральной области
излучаемого света;
- для веществ, содержащих радионуклиды: подходящий
счетчик радиоактивности; для него необходимо
проверить линейный диапазон.
Методика. Испытуемый раствор и растворы сравнения
готовят в соответствии с указаниями в частной
статье, используя один и тот же растворитель.
На пластинку наносят одинаковый объем каждого
раствора и хроматографируют.
Вещества, поглощающие или флуоресцирующие в
ультрафиолетовом или видимом свете. Готовят и наносят
на пластинку не менее трех растворов сравнения,
концентрации которых охватывают ожидаемое
значение концентрации в испытуемом растворе (около
80 %, 100 % и 120 % от этой концентрации). Опрыскивают,
при необходимости, указанным реактивом
и регистрируют отражение, пропускание или флуоресценцию
на хроматограммах, полученных для испытуемого
раствора и растворов сравнения. По полученным
данным рассчитывают количество вещества
в испытуемом растворе.
Вещества, содержащие радионуклиды. Готовят и наносят
на пластинку испытуемый раствор, содержащий
около 100 % ожидаемого значения концентрации.
Измеряют радиоактивность как функцию длины
пути и записывают радиоактивность каждого полученного
пика в процентах от суммарной радиоактивности.
При отсутствии других указаний в частной статье
результаты определения считают недействительными,
если коэффициент разделения ( R J между измеряемыми
на хроматограмме пиками менее 1.0.
Коэффициент разделения (RJ вычисляют по
формуле:
RS
1-18 & - Z J
ь + ь
Ь а '
где
Z B , ZO — расстояния вдоль базовой линии
между точкой нанесения образца и перпендикулярами,
опущенными из вершин двух соседних пиков, в
миллиметрах;
^QSo' ^QSb ~ ширина пиков на половине высоты,
в миллиметрах.
В случае установления предельного содержания при-
Алесей с помощью фотометрического детектора важным
параметром для определения предела обнаружения
является отношение сигнал/шум (S/N):
S 2Н
N h
где
H - высота пика анализируемого компонента
на хроматограмме раствора сравнения, измеренная
от вершины до базовой линии; базовая линия
измеряется при этом в интервале двадцати ширин пика,
измеренных на половине его высоты;
Л — максимальная амплитуда фонового шума
на хроматограмме холостого раствора, наблюдаемая
в том же интервале, что и для испытуемого раствора.
ОБОРУДОВАНИЕ
Пластинки. Допускается использование пластинок,
приготовленных в промышленных условиях, если они
отвечают требованиям раздела 4.1.1. «Реактивы», а
также выдерживают испытание «Проверка пригодности
хроматографической системы», описанное в частной
статье.
Хроматографическая камера. В необходимых
случаях допускается использование хроматографических
камер других типов с описанием их в частных статьях.
Допускаются другие условия активации пластинок,
описанные в частных статьях.
МЕТОДИКА
При отсутствии других указаний в частной статье хро-
матографическое разделение выполняют восходящим
способом в насыщенной атмосфере.
Предпочтительнее использовать такие подвижные
фазы, которые обеспечивают величины R испытуемых
соединений в пределах от 0.3 до 0.7.
При отсутствии других указаний в частной статье пятна
или полосы наносят на расстоянии не менее
15 мм от нижнего края и не менее 10 мм от боковых
краев пластинки.
Слой жидкости в хроматографической камере должен
быть таким, чтобы после помещения в него пластинки
пятна или полосы находились над уровнем жидкости.
Если условия насыщения хроматографической камеры,
нанесения пятен или хроматографирования отличаются
от указанных выше, они должны быть описаны
в частной статье.
ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
Результаты анализа методом тонкослойной хроматографии
(TCX) считаются достоверными, если выполняются
требования испытания «Проверка пригодности
хроматографической системы».
Хроматографическая система считается пригодной,
если:
- на хроматограмме раствора сравнения, используемого
для проверки пригодности хроматографической
системы, четко делятся пятна указанных в частной статье
веществ;
- R1 основного пятна на хроматограмме испытуемого
раствора должно быть около величины, указанной в
частной статье;
- на хроматограмме раствора сравнения, используемого
для проверки чувствительности хроматографической
системы, должно быть четко видно пятно.
СПОСОБЫ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ПРИМЕСЕЙ
МЕТОДОМ TCX
При контроле примесей нецелесообразно включение
в частную статью требования отсутствия пятна контролируемой
примеси на хроматограмме испытуемого
раствора.
Методом TCX определяют:
- содержание идентифицируемых примесей;
- общее содержание примесей.
КОНТРОЛЬ ИДЕНТИФИЦИРУЕМЫХ ПРИМЕСЕЙ
Контроль идентифицируемых примесей применяют в
тех случаях, когда содержание каких-то конкретных
примесей, возникающих в процессе производства
препарата или его хранения, должно быть ограничено
ввиду их токсичности или по другим соображениям.
При контроле идентифицируемых примесей обычно
используют сравнение пятен регламентируемых примесей
на хроматограммах испытуемого раствора и
растворов сравнения.
Типичная регламентация содержания примеси выглядит
в этом случае следующим образом:
«На хроматограмме испытуемого раствора, кроме
основного пятна, допускается наличие дополнительного
пятна, расположенного на уровне пятна на
хроматограмме раствора сравнения и не превышающего
его по величине и интенсивности поглощения
или окраски (... %)».
КОНТРОЛЬ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ПРИМЕСЕЙ
В тех случаях, когда примеси не являются особо токсичными,
часто не ток важно знать их истинное содержание.
Необходимо лишь установить, что это содержание
не превосходит определенного уровня. В
таких случаях используют метод внутренней нормализации
- в качестве растворов сравнения обычно используют
растворы самой испытуемой субстанции
различной концентрации, а содержание примесей
находят в пересчете на эту субстанцию.
В зависимости от количества различных растворов
субстанции, наносимых на хроматограмму в виде растворов
сравнения, контроль общего содержания
примесей может быть одноуровневым, двухуровневым
и трехуровневым.
Типичная регламентация содержания прим.еси в одноуровневом,
варианте указывается следующим образом:
«На хроматограмме испытуемого раствора любое
пятно, кроме основного пятна, не должно превышать
по величине и интенсивности поглощения или
окраски пятно на хроматограмме раствора сравнения
(... %)».
Типичная регламентация содержания примеси в двухуровневом
варианте выглядит следующим образом:
«На хроматогралте испытуемого раствора любое
пятно, кроме основного пятна, не должно превышать
по величине и интенсивности поглощения или окраски
основное пятно на хроматограмме раствора сравнения
1 (... %), и только одно пятно может быть интенсивнее
пятна на хроматограмме раствора сравнения
2(... %)».
Типичная регламентация содержания прим,еси в трехуровневом
варианте выглядит следующим образом:
«На хроматограмме испытуемого раствора любое
пятно, кроме основного пятна, не должно превышать
по величине и интенсивности поглощения или окраски
основное пятно на хроматограмме раствора сравнения
1 (... %), и только одно пятно может быть интенсивнее
пятна на хроматограмме раствора сравнения
2(... %), и не более чем ...пятен могут быть интенсивнее
основного пятна на хроматограмме раствора
сравнения 3 (... %}».
В двух- и трехуровневом вариантах возможна регламентация
и общей суммы примесей.
2.2.28. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Газовая хроматография (ГХ) - это метод хроматогра-
фического разделения, основанный на разности распределения
веществ между двумя несмешивающими-
ся фазами, в котором газ-носитель, являющийся подвижной
фазой, проходит через неподвижную фазу,
находящуюся в колонке. Метод применяют к летучим
при нагревании веществам или их производным.
Газовая хроматография основана на механизмах адсорбции
и/или распределения.
ОБОРУДОВАНИЕ
Оборудование состоит из устройства ввода проб (инжектора),
хроматографической колонки, помещенной
в печь, детектора и регистрирующей системы (интегратора
и самописца). Газ-носитель проходит с заданной
скоростью через устройство ввода пробы, колонку,
а затем через детектор.
Определение проводят при постоянной температуре
или в соответствии с заданной температурной программой.
УСТРОЙСТВО ВВОДА ПРОБ (ИНЖЕКТОРЫ)
Прямое введение растворов является обычным способом
инжекции при отсутствии других указаний в
частной статье. Пробу вводят с помощью шприца или
инъекционного клапана либо непосредственно в верхнюю
часть колонки, либо в испарительную камеру,
снабженную распылителем.
Введение паровой фазы проводят с помощью статического
или динамического устройства ввода проб.
Динамические парафазные устройства ввода проб
(очиститель и ловушка) включают распылитель, с помощью
которого летучие вещества продувают в колонку,
которую выдерживают при низкой температуре.
Затем удерживаемые адсорбентом вещества де-
сорбируют в подвижную фазу путем его быстрого
нагревания.
Статические парафазные устройства ввода проб включают
пробоотборник, термостатирующую нагревательную
камеру, в которой выдерживают определенное
время закрытые флаконы, содержащие твердые или
жидкие пробы, для установления равновесия между
летучими компонентами проб и негазообразной и
паровой фазами. После установления равновесия
заданное количество летучих компонентов во флаконах
продувают в газовый хроматограф.
НЕПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ
Типы колонок, заполняемые неподвижной фазой:
- капиллярная колонка из расплавленного кремнезема
(кремния диоксида), стенки которой покрыты неподвижной
фазой;
- колонка, заполненная инертными частицами, пропитанными
неподвижной фазой;
- колонка, заполненная твердой неподвижной фазой.
Капиллярные колонки имеют длину от 5 м до 60 м с
внутренним диаметром от 0.1 мм до 0.53 мм. Жидкость
или неподвижная фаза, химически связанные с
внутренней поверхностью, представляют собой пленку
Т О Л Щ И Н О Й O T 0.1 AtKM до 5.0 мкм.
Заполненные колонки из стекла или металла имеют
длину от 1 м до 3 м с внутренним диаметром от 2 мм
до 4 мм. Неподвижные фазы обычно состоят из пористых
полимеров или твердых носителей, пропитанных
жидкой фазой.
Во избежание размывания пика при определении
полярных соединений на колонках, заполненных неподвижной
фазой с низкой пропускной способностью
и низкой полярностью, следует использовать инертные
носители. Для уменьшения реакционной способности
носителей допускается силанизация перед нанесением
на их поверхность жидкой фазы. Часто используют
промытый кислотой флюс-кальцинированный
диатомит (кизельгур). В большинстве случаев применяют
носители с размером частиц от 150 мкм до
180 мкм и от 125 мкм до 150 мкм.
ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ
Время удерживания и четкость пика зависят от скорости
движения газа~носителя. Время удерживания прямо
пропорционально длине колонки, а коэффициент
разделения пропорционален корню квадратному от
длины колонки. Скорость газа_носителя через заполненную
колонку обычно выражают в миллилитрах в
минуту при атмосферном давлении и комнатной температуре.
Скорость потока измеряют на выходе детектора
либо с помощью калиброванного механического
устройства, либо клапанного устройства при
рабочей температуре колонки. Линейная скорость
газа-носителя через заполненную колонку обратно
пропорциональна корню квадратному от внутреннего
диаметра колонки для заданного протекающего
объема. Скорости потока от 60 мл/мин в колонке с
внутренним диаметром 4 мм и 15 мл/мин в колонке с
внутренним диаметром 2 мм дают идентичные линейные
скорости и, следовательно, сходные времена удерживания.
Для заполненных колонок в качестве газа _ носителя
обычно используют гелий и азот, о для капиллярных
колонок - азот, гелий и водород.
ДЕТЕКТОРЫ
Обычно применяют пламенно-ионизационные детекторы.
Допускается использование детекторов электронного
захвата, азотно-фосфорных, масс-спектро-
метрических, по теплопроводимости, инфракрасных
спектрометрических с Фурье - преобразованием и
других в зависимости от цели анализа.
МЕТОДИКА
Колонку, устройство ввода проб и детектор уравновешивают
при температурах и скоростях потока газа
до достижения устойчивого исходного состояния в
соответствии с указаниями в частной статье. Готовят
испытуемый раствор(ы) и раствор(ы) сравнения в соответствии
с описанием в частной статье. Растворы
не должны содержать твердых частиц.
Используя растворы сравнения, настраивают прибор
и подбирают объемы вводимых проб, которые позволяют
получить необходимый сигнал. Выполняют повторные
введения для проверки сходимости сигнала и проверяют
при необходимости число теоретических тарелок.
Вводят растворы и регистрируют результаты хроматографирования.
Для проверки сходимости сигнала
выполняют повторные введения. Определяют площади
пиков анализируемых компонентов. В случае, если
коэффициент симметрии, вычисленный, как описано
ниже, имеет значение от 0.8 до 1.20, то допускается
определение по высоте пиков. При использовании
программирования температуры необходимо проводить
определение по площадям пиков. При использовании
внутреннего стандарта следует удостовериться,
что ни один из пиков, относящихся к анопизируе-
мому веществу или его примеси, не маскируется пиком
внутреннего стандарта.
Из полученных значений вычисляют содержание анализируемого
компонента или компонентов. Если указано
в частной статье, процентное содержание одного
или нескольких компонентов анализируемой пробы
определяют посредством вычисления процентной
доли площади соответствующего пика или пиков в
суммарной площади всех пиков, исключая пики растворителей
или добавленных реактивов (метод внутренней
нормализации). В этих случаях рекомендуется
использование широкодиапазонного усилителя и автоматического
интегратора.
Коэффициент симметрии пика может быть вычислен
по формуле:
Ь „„,
2 А
где
Ь005 - ширина пика на одной двадцатой высоты
пика;
А - расстояние между перпендикуляром, опущенным
из максимума пика, и передней границей пика
на одной двадцатой высоты пика.
Коэффициент разделения (RJ может быть вычислен
по формуле:
ь + ь
0.5а 0.5Ь
t >/
Rb На
где
'» и '*, - расстояния вдоль базовой линии
от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных
из максимумов двух соседних пиков, в миллиметрах;
0 Ьо 0 5Ь
соты в миллиметрах.
ширина пиков на половине их вы-
При отсутствии других указаний в частной статье результаты
анализа считаются достоверными, если коэффициент
разделения для измеряемых пиков на хроматограмме
больше 1.0.
Число теоретических тарелок (п) может быть вычислено
из данных, полученных в изотермическом
режиме, по формуле:
. =5.54
05
где
tg - расстояние вдоль базовой линии от точки
ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из
максимума пика анализируемого вещество, в миллиметрах,
bQ5 - ширина пика на половине высоты в миллиметрах.
Коэффициент емкости /г'(известный также как коэффициент
распределения масс D ) определяют как:
D -к'
КВНФ
КВПФ
И
- К
где
КВНФ- количество растворенного вещества в
неподвижной фазе;
КВПФ- количество растворенного вещества в
подвижной фазе;
К - равновесный коэффициент распределения;
V - объем неподвижной фазы;
V - объем подвижной фазы.
Коэффициент емкости компонента может быть определен
из данных хроматограммы по формуле:
D = k' =
где
tR - расстояние вдоль базовой линии от точки ввода
пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума
пика анализируемого компонента, . миллиметрах;
/\, - расстояние вдоль базовой линии от точки ввода
пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума
пика неудерживаемого компонента, в миллиметрах.
Отношение сигнал/шум (S/Nj вычисляют по формуле:
2Н
h
л
где
H - высота пика соответствующего компонента на
хроматограмме, полученной для указанного раствора
сравнения;
h - абсолютное значение наибольшей флуктуации
шума базовой линии на хроматограмме холостого
раствора, наблюдаемое на промежутке, равном двадцатикратной
ширине на полувысоте пика на хроматограмме
раствора сравнения, размещенном равномерно
вокруг места расположения пика.
ПАРОФАЗНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Парофазная газовая хроматография является методом,
наиболее подходящим для разделения и определения
летучих соединений, которые присутствуют в
твердых или жидких образцах. Метод основан на анализе
паровой фазы, находящейся в равновесии с твердой
или жидкой фазой.
Оборудование. Оборудование состоит из газового
хроматографа, снабженного устройством для ввода
паровой фазы, находящейся над испытуемым образцом.
Устройство ввода может быть подсоединено
к блоку, автоматически контролирующему и регулирующему
давление и температуру. При необходимости
используют устройство для удаления растворителей.
Анализируемую пробу вводят в контейнер, снабженный
подходящей пробкой и клапанной системой, которая
регулирует прохождение газа-носителя. Контейнер
помещают в термостатируемую камеру с температурой,
устанавливаемой в соответствии со свойствами
анализируемого образца.
Пробу выдерживают при заданной температуре в
течение времени, достаточном для установления равновесия
между твердой или жидкой фазой и паровой
фазой.
В контейнер вводят гоз-носитель и по истечении указанного
времени открывают клапан, чтобы газ поступал
в хроматографическую колонку, перенося с собой
перешедшие в паровую фазу компоненты.
Вместо использования хродлатографа, специально
оснащенного устройством для ввода паровой фазы,
возможно также использование герметических шприцов
и хроматографа без указанного устройства. В
этом случае равновесие устанавливается в отдельной
камере, и паровая фаза переносится в колонку с соблюдением
необходимых мер предосторожности для
предотвращения любых изменений равновесного состава.
Методика. Настраивают прибор для получения необходимого
сигнала, используя подготовленные образцы
сравнения
a) Способ прямой калибровки
В одинаковые контейнеры раздельно помещают анализируемую
пробу и каждый из образцов сравнения,
приготовленные в соответствии с указаниями в частной
статье, избегая контакта между устройством для
ввода проб и образцами.
Контейнеры герметично закрывают и помещают в
термостатируемую камеру с температурой и давлением,
указанными в частной статье. После установления
равновесия паровую фазу хроматографируют в
указанных условиях.
b) Способ стандартных добавок
Равные объемы анализируемой пробы помещают в
одинаковые, указанные в частной статье, контейнеры.
Во все контейнеры, кроме одного, прибавляют
указанные количества раствора сравнения, содержащего
известную концентрацию анализируемого вещества,
для получения ряда образцов, с равномерно
увеличивающимися концентрациями этого вещества.
Контейнеры герметично закрывают и помещают в
термостатируемую камеру с температурой и давлением,
указанными в частной статье. После установления
равновесия хроматографируют паровую фазу в
указанных условиях.
Уравнение линейной зависимости рассчитывают методом
наименьших квадратов. По полученному уравнению
определяют концентрацию анализируемого
вещества в испытуемой пробе.
Допускается определение концентрации с использованием
графического метода. Для этого по оси ординат
откладывают средние значения полученных результатов,
а по оси абсцисс - концентрации стандартных
добавок анализируемого вещества. Экстраполируют
линию, проходящую через полученные точки,
до пересечения с осью абсцисс. Расстояние между
этой точкой и началом координат представляет собой
концентрацию анализируемого вещества в испытуемом
растворе.
c) Способ последовательных отборов
Применение данного способа описывают в частной
статье.
Оборудование. Обычно детектирование основано
но эффектах ионизации в пламени, теплопроводности,
термоионном эффекте или на эффекте захвата
электронов. Использование детекторов, основанных
на других принципах, требует соответствующего обоснования.
При этом следует подробно указывать режим
их работы.
МЕТОДИКА
Перед использованием колонка должна быть кондиционирована.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Относительное время удерживания - это отношение
времени удерживания анализируемого вещества к
времени удерживания вещества, принятого за стандарт.
Идентификацию обычно проводят одним из следующих
способов:
1) сравнение времен удерживания анализируемого
вещества в испытуемой пробе и растворе сравнения;
2) сравнение относительных времен удерживания
анализируемого вещества в испытуемой пробе и растворе
сравнения;
3) сравнение хроматограммы испытуемой пробы
с хроматограммой раствора сравнения или с хрома-
тограммой, приведенной в частной статье.
Обычно используют первый способ. Второй способ
используют при плохой воспроизводимости условий
хроматографирования. Третий способ оптимален для
препаратов растительного и животного происхождения.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Абсолютная калибровка. При отсутствии других
указаний в частной статье испытуемый раствор и раствор
сравнения попеременно хроматографируют на
газовом хроматографе, получая не менее пяти хроматограмм,
в условиях, указанных в частной статье.
Для испытуемого раствора и раствора сравнения
рассчитывают средние значения площадей или высот
пиков анализируемого вещества. По полученным средним
значениям рассчитывают концентрацию анализируемого
вещества в испытуемом растворе.
Способ внутреннего стандарта. Для каждой хроматограммы
сначала рассчитывают отношение площади
или высоты пика анализируемого вещества к
площади или высоте пика внутреннего стандарта.
Полученные отношения усредняют для испытуемого
раствора и раствора сравнения и по найденным средним
значениям определяют концентрацию анализируемого
вещества в испытуемом растворе.
КОНТРОЛЬ ПРИМЕСЕЙ
Для контроля примесей обычно используют следующие
подходы.
/. Количественное определение примеси с использованием
раствора сравнения с известной концентрацией
примеси (обычно в варианте абсолютной калибровки).
Такой подход предполагает одинаковый
отклик примеси в присутствии и в отсутствии основного
вещества.
2. Способ внутренней нормализации. Такой подход
предполагает выполнение линейности в широком
диапазоне и может потребовать учета различий в
откликах примеси и основного вещества. Его часто
применяют для определения суммы примесей. При этом
сумму площадей всех пиков на хроматограмме (без
учета пика растворителя) принимают за 100 % и содержание
каждой конкретной примеси или суммы
примесей находят как долю площади пика этой примеси
или суммы площадей пиков примесей в общей
сумме площадей всех пиков на хроматограмме.
3. Сравнение с разбавленным раствором основного
вещества.
4. Способ стандартных добавок. К анализируемой
пробе прибавляют известное количество примеси.
По данным хроматографирования испытуемой
пробы и испытуемой пробы с добавкой определяют
содержание примеси. Для повышения точности возможно
использование способа внутреннего стандарта.
УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
В методике рекомендуется указывать следующие условия
анализа:
размеры хроматографической колонки и материал,
из которого она изготовлена;
тип неподвижной фазы и ее количество;
тип твердого носителя и размер его частиц;
температуру колонки, испарителя и детектора;
газ-носитель и его расход;
тип детектора;
необходимость использования автосамплера;
коэффициент деления потока (для капиллярных
колонок).
Если введение пробы осуществляется не в испари-
тель, . непосредственно в колонку, следует давать
соответствующее указание в методике, приведенной
в частной статье.
Пригодность хроматографической системы. Результаты
анализа считаются достоверными, если выполняются
требования теста «Проверка пригодности
хроматографической системы». Данный тест обычно
проводят с использованием растворов сравнения.
При отсутствии других указаний в частной статье хро-
матографическая система считается пригодной при
выполнении следующих условий:
относительные времена удерживания указанных
веществ должны быть около регламентируемых значений;
число теоретических тарелок (эффективность
хроматографической системы), рассчитанное по указанному
пику, должно быть не менее регламентируемой
величины;
коэффициент разделения указанных пиков должен
быть не менее указанной величины;
относительное стандартное отклонение, рассчитанное
для высоты или площади указанного пика
или их отношений к высоте или площади внутреннего
стандарта из хроматограмм раствора сравнения,
должно быть не более регламентируемой величины;
для расчета относительного стандартного отклонения
используют данные пяти параллельных хроматограмм;
если требуемое относительное стандартное отклонение
превышает 2.0 %, его расчет проводят, используя
данные шести или более параллельных хроматограмм;
коэффициент симметрии указанного пика, рассчитанный
из хроматограмм раствора сравнения,
должен быть в пределах, указанных в частной статье.
Для обеспечения выполнения требований теста «Проверка
пригодности хроматографической системы»
допускается модификация хроматографических условий,
описанных в частной статье (изменение температуры
термостата колонок и/или расход газа-носителя).
ПАРОФАЗНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Оборудование. Для качественного и полуколичественного
анализа возможно использование других
способов ввода паровой фазы в хроматографическую
колонку.
2.2.29. ЖИДКОСТНАЯ
ХРОМАТОГРАФИЯ
сти распределения веществ между двумя несмешива-
ющимися фазами, в котором жидкость, являющаяся
подвижной фазой, проходит через неподвижную фазу,
находящуюся в колонке.
Жидкостная хроматография основана на механизмах
адсорбции, распределения, ионного обмена или разделения
по размерам молекул.
ОБОРУДОВАНИЕ
Оборудование состоит из насосной системы, устройства
ввода проб, хроматографической колонки (допускается
использование термостата для колонки),
детектора и регистрирующего устройства (интегратора
и самописца).
Подвижная фаза, обычно подаваемая под давлением
из одной или нескольких емкостей, протекает через
устройство ввода пробы, колонку, а затем через детектор
с заданной скоростью.
НАСОСНАЯ СИСТЕМА
В ЖХ насосная система необходима для доставки
подвижной фазы с постоянной скоростью потока. Перепады
давления должны быть сведены к минимуму,
например, путем прохождения растворителя под давлением
через демпферное устройство. Система труб
и соединений должны выдерживать давление, развиваемое
насосной системой. Допускается использование
в ЖХ насосов, оснащенных устройством для
«прокачки» пузырьков захваченного воздуха.
Микропроцессоры, представляющие собой контролирующую
систему, подают подвижную фазу или постоянного
(изократическое элюирование), или переменного
(градиентное элюирование) состава в соответствии
с задаваемой программой. В случае градиентного
элюирования насосные системы доставляют из
нескольких резервуаров растворители, смешивание
которых происходит либо при низком, либо высоком
давлении, создаваемом насосами.
УСТРОЙСТВО ВВОДА ПРОБ (ИНЖЕКТОРЫ)
Пробу раствора вводят в движущуюся подвижную фазу
в верхнюю часть колонки или рядом с ней с помощью
устройства ввода проб, работающего при высоком
давлении. Используют закрепленные петли и устройство
с меняющимся объемом, которые действуют вручную
или автоматически. Заполнение петель вручную
снижает точность введения объема.
НЕПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ
Жидкостная хроматография (ЖХ) - это метод хрома-
тогрофического разделения, основанный на разно- Типы неподвижных фаз, применяемых в ЖХ:
- силикагель, алюминия оксид или пористый графит,
используемые в нормально-фазовой хроматографии,
в которой разделение основано на разности в адсорбции
и / или массовом распределении;
- смолы или полимеры с кислотными или основными
группами, используемые в ионно-обменной хроматографии,
в которой разделение основано на конкуренции
между разделяемыми ионами и ионами, находящимися
в подвижной фазе;
- пористый силикагель или полимеры, используемые в
эксклюзионной хроматографии, в которой разделение
происходит в соответствии с размерами молекул;
- химически модифицированные носители, приготовленные
из полимеров, кремнезема или пористого графита
и используемые в обращенно-фазовой ЖХ, в
которой разделение основано, главным образом, на
распределении молекул между подвижной и неподвижной
фазами;
- специальные химически модифицированные неподвижные
фазы такие, как, например, целлюлоза или
производные амилозы, протеины или пептиды, цикло-
декстрины и т.д., используемые для разделения энан-
тиомеров (хиральная хроматография).
В большинстве случаев механизм разделения основан
на использовании в качестве неподвижной фазы
химически модифицированного кремнезема, а в качестве
подвижной фазы - полярных растворителей. На
поверхности носителя, такого, как, например, кремнезем
им.еются силанольные группы, которые, взаимодействуя
с различными силановыми реагентами,
образуют ковалентно связанные силилированные
производные, покрывающие различное число активных
центров на его поверхности. Природа функционально
привитой фазы является важным параметром,
определяющим разделительные свойства хроматографической
системы.
Наиболее часто используют следующие функционально
привитые фазы:
октил - Si - [CH2I7 - CH3 C8
октадецил - Si - [CHJ17 - с н 3 C18
фенил - Si - [CHJn "C6H5 C6H5
цианопропил - Si - [CHJ3 • - CN CN
аминопропил - Si - [CHJ3 • - NH0 NH2
диол - Si - [CHJ3 -- О -CH(OH) - сн2 -
Силикагель, являющийся носителем в обращенно-фа-
зовых колонках, должен быть устойчивым в подвижных
фазах при значении рН в области от 2.0 до 8.0 при
отсутствии других указаний производителя. Колонки,
содержащие пористый графит или частицы полимерных
материалов, таких, как, например, сополимер
стирола с дивинилбензолом, устойчивы в более широкой
области рН.
В определенных случаях в нормально-фазовой хроматографии
применяют неполярную подвижную фазу,
а в качестве неподвижной фазы - немодифицирован-
ный кремнезем, пористый графит или полярный химически
модифицированный кремнезем с такими группами
как, например, цианопропил или диол.
Размеры частиц для большинства используемых неподвижных
фаз должны быть от 3 мкм и 10 мкм. Частицы
могут иметь сферическую или неправильную
форму, различную пористость и удельную поверхность.
Данные параметры оказывают влияние на хроматог-
рафическое поведение неподвижных фаз. В случае
обращенных фаз дополнительным фактором являются
природа неподвижной фазы и степень связывания
активных центров, например, содержание углерода
или эндкепирование (силилирование оставшихся си-
ланольных групп). Наличие остаточных силанольных
групп обусловливает размытость пиков, особенно
основных веществ.
Для аналитической хроматографии используют колонки
из нержавеющей стали различной длины и внутреннего
диаметра при отсутствии других указаний в частной
статье.
Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм часто
относят к микроколонком. Температура подвижной
фазы и колонки должна быть постоянной в течение
анализа. Чаще всего разделение проводят при комнатной
температуре, допускается нагревание колонки
для повышения ее эффективности, но не более 60 0C
из-за возможности уменьшения потенциала неподвижной
фазы или изменения состава подвижной фазы.
ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫ
Для нормально-фазовой хроматографии применяют
менее полярные растворители. Присутствие воды е
подвижной фазе следует строго контролировать для
получения воспроизводимых результатов. В обращенно-
фазовой ЖХ применяют водные подвижные фазы с
органическими модификаторами и без них.
Компоненты подвижной фазы обычно фильтруют для
удаления частиц с размером более 0.45 мкм. Многокомпонентные
подвижные фазы готовят, отмеряя требуемые
объемы (если массы не определены) индивидуальных
компонентов с последующим их смешиванием.
Допускается подача растворителей с помощью
индивидуальных насосов, количество растворителей
и их смешивание в необходимых пропорциях контролируют
посредством дозирующих клапанов. Растворители
обычно дегазируют перед подкачкой либо путем
продувания гелием, либо обработкой ультразвуком,
либо использованием ряда мембранвакуумных
модулей во избежание образования пузырьков газа в
детекторной ячейке.
При применении ультрафиолетового детектора растворители
для приготовления подвижной фазы должны
быть свободными от стабилизаторов и прозрачными
при регистрируемой длине волны. Растворители и
другие используемые компоненты должны быть приемлемого
качества. При необходимости рН регулируют,
используя только водный компонент подвижной
фазы. При использовании буферных растворов для
предотвращения кристаллизации солей по окончании
хроматографирования систему промывают достаточным
количеством смеси воды и органического модификатора
подвижной фазы (5 % об/об).
Допускается содержание в подвижной фазе других
компонентов, например, таких как противоион в ион-
но-парной хроматографии или хиральный селектор
для хроматографии, использующей оптически неактивную
неподвижную фазу.
ДЕТЕКТОРЫ
Наиболее часто в качестве детекторов применяют
спектрофотометры в ультрафиолетовой и видимой
области, включающие диодный набор детекторов.
Допускается использование флуоресцентных спектрофотометров,
дифференциальных рефрактометров,
электрохимических детекторов, масс-спектрометров,
светорассеивающих, радиоактивных и других специальных
детекторов.
МЕТОДИКА
Колонку уравновешивают с подвижной фазой и скоростью
потока до установления устойчивого исходного
состояния при комнатной температуре или температуре,
указанной в частной статье. Готовят испытуемый
раствор(ы) и раствор(ы) сравнения в соответствии
с описанием в частной статье. Растворы не должны
содержать твердых частиц.
Используя растворы сравнения, настраивают прибор
и подбирают объемны вводимых проб, которые позволяют
получить необходимый (адекватный) сигнал. Выполняют
повторные введения для проверки сходимости
сигнала и проверяют при необходимости число
теоретических тарелок.
Вводят растворы и регистрируют результаты хроматографирования.
Для проверки сходимости сигнала
выполняют повторные введения. Определяют площади
пиков анализируемых компонентов. В случае, если
коэффициент симметрии, вычисленный, как описано
ниже, имеет значение от 0.8 до 1,20, допускается
проводить определение по высоте пиков. При использовании
градиентного элюирования необходимо проводить
определение по площадям пиков. При использовании
внутреннего стандарта следует удостовериться,
что ни один из пиков анализируемого вещества
или его примеси не маскируется пиком внутреннего
стандарта.
Из полученных значений вычисляют содержание определяемого
компонента или компонентов. Если указано
в частной статье, процентное содержание одного
или нескольких компонентов анализируемой пробы
определяют посредством вычисления процентной
доли площади соответствующего пика или пиков к
суммарной площади всех пиков, исключая пики растворителей
или добавленных реактивов (метод внутренней
нормализации). В этих случаях рекомендуется
использование широкодиапазонного усилителя и автоматического
интегратора.
Коэффициент симметрии пика может быть вычислен
по формуле:
2 А
где
Ьсо< - ширина пика на одной двадцатой высоты пика;
А - расстояние между перпендикуляром, опущенным
из максимума пика, и передней границей пика на
одной двадцатой высоты пика.
Коэффициент разделения ( R J может быть вычислен
по формуле:
R5 =
Ь0.5а + Ь05Ь
^Rb > ^Ra '
где
/„. и /„ - расстояния вдоль базовой линии от точки
ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов
двух соседних пиков в миллиметрах;
Ь,е и - ширина пиков на половине высоты в
С Do 0 Db ~
миллиметрах.
При отсутствии других указаний в частной статье результаты
анализа считаются достоверными, если коэффициент
разделения для измеряемых пиков на хроматограмме
больше 1.0.
Число теоретических тарелок (п) может быть вычислено
из данных, полученных в изократическом режиме,
по формуле:
. =5.54
где
t - расстояние вдоль базовой линии от точки
ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из
максимума пика анализируемого вещества в миллиметрах;
6 f l i
_ ширина пика на половине высоты в миллиметрах.
Коэффициент емкости /(-'(известный также как коэффициент
распределения масс Д^/определяют как:
КВНФ
D = •-K-
КВПФ
t > t
Rb Ro,
где
КВНФ - количество растворенного вещества в неподвижной
фазе;
КВПФ - количество растворенного вещества в подвижной
фазе;
К - равновесный коэффициент распределения;
V - объем, неподвижной фазы;
V - объем подвижной фазы.
т
Коэффициент емкости компонента может быть определен
из данных хроматограммы по формуле:
4 - /„
D =
где
/? - расстояние вдоль базовой линии от точки ввода
пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума
пика анализируемого компонента в миллиметрах;
.,. - расстояние вдоль базовой линии отточки ввода
пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума
пика неудерживаемого компонента в миллиметрах.
Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по
формуле:
2Н
S / H =
где
H высота пика соответствующего компонента на
хроматограмме, полученной для указанного раствора
сравнения;
hn - абсолютное значение наибольшей флуктуации
шума базовой линии на хроматограмме холостого
раствора, наблюдаемое на промежутке, равном двадцатикратной
ширине на полувысоте пика на хроматограмме
раствора сравнения, размещенном равномерно
вокруг места расположения пика.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Относительное время удерживания — это отношение
времени удерживания анализируемого вещества к
времени удерживания вещества, принятого за стандарт.
Идентификацию обычно проводят одним из следующих
способов:
1) сравнение времен удерживания анализируемого
вещества в испытуемой пробе и растворе сравнения;
2) сравнение относительных времен удерживания анализируемого
вещества в испытуемой пробе и растворе
сравнения;
3) сравнение хроматограммы испытуемой пробы с
хроматограммой раствора сравнения или хроматог-
раммой, приведенной в частной статье.
Обычно используют первый способ. Второй способ
целесообразно использовать, если невозможно воспроизвести
условия хроматографирования. Третий способ
может применяться для препаратов растительного
и животного происхождения.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Абсолютная калибровка. При отсутствии других
указаний в частной статье, испытуемый раствор и
раствор сравнения попеременно хроматографируют
на жидкостном хроматографе, получая не менее пяти
хроматограмм, в условиях, указанных в частной статье.
Для испытуемого раствора и раствора сравнения
рассчитывают средние значения площадей или высот
пиков анализируемого вещества. По полученным средним
значениям рассчитывают концентрацию анализируемого
вещества в испытуемом растворе.
Способ внутреннего стандарта. Для каждой хроматограммы
сначала рассчитывают отношение площади
или высоты пика анализируемого вещества к
площади или высоте пика внутреннего стандарта. Полученные
отношения усредняют для испытуемого раствора
и раствора сравнения и по найденным средним
значениям определяют концентрацию анализируемого
вещества в испытуемом растворе.
обычно проводят с использованием растворов
сравнения.
При отсутствии других указаний в частной статье,
хроматографическая система считается пригодной
при выполнении следующих условий:
- относительные времена удерживания указанных
веществ должны быть около указанных значений;
- число теоретических тарелок (эффективность хроматографической
системы), рассчитанное по указанному
пику, должно превышать предельное приведенное
значение;
- коэффициент разделения указанных пиков, рассчитанный
из хроматограмм раствора сравнения,
должен превышать указанную величину;
- относительное стандартное отклонение, рассчитанное
для высоты или площади указанного пика
или их отношений к высоте или площади, или высоте
пика внутреннего стандарта из хроматограмм
раствора сравнения, должно быть меньше указанной
величины; для расчета относительного стандартного
отклонения используют данные обычно
пяти параллельных хроматограмм,
- коэффициент симметрии указанного пика, рассчитанный
из хроматограмм раствора сравнения,
должен быть в пределах, указанных в частной статье.
Для обеспечения выполнения требований теста
«Проверка пригодности хроматографической системы
» допускается модификация хроматографических
условий, описанная в частной статье.
2.2.31. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ОБЩИЙ ПРИНЦИП
Под действием электрического поля заряженные частицы,
растворенные или взвешенные в растворе электролита,
мигрируют в направлении электрода, несущего
противоположный заряд. При гель-электрофорезе
движение частиц затруднено вследствие их взаимодействия
с окружающей матрицей геля, действующей
как молекулярное сито. Противоположные взаимодействия
электрического поля и молекулярного сита
приводят к дифференциации скоростей движения частиц
в соответствии с их размерами, формами и зарядами.
В процессе электрофореза макромолекулы
смеси вследствие различия физико-химических свойств
мигрируют с разной скоростью, разделяясь таким
образом на дискретные фракции. Электрофоретичес-
кое разделение можно проводить в системах без носителей
(например, свободное разделение раствора
в капиллярном электрофорезе) и в стабилизированной
среде такой как, например, тонкослойные пластинки,
пленки или гели.
Для контроля примесей обычно используют следующие
подходы.
/. Количественное определение примеси с использованием
раствора сравнения с известной концентрацией
примеси (обычно в варианте абсолютной
калибровки). Такой подход предполагает одинаковый
отклик примеси в присутствии и в отсутствии
основного вещества.
2. Способ внутренней нормализации. Такой подход
предполагает выполнение линейности в широком
диапазоне и может потребовать учета различий
в откликах примеси и основного вещества. Его
часто применяют для определения суммы примесей.
При этом сумму площадей всех пиков на хроматограмме
(без учета пика растворителя) принимают
за 100 % и содержание каждой конкретной
примеси или суммы примесей находят как долю
площади пика этой примеси или суммы площадей
пиков примесей в общей сумме площадей всех пиков
на хроматограмме.
3. Сравнение с разбавленным раствором основного
вещества.
4. Способ стандартных добавок. Канализируемой
пробе добавляют известное количество примеси.
По данным хроматографирования испытуемой пробы
и испытуемой пробы с добавкой определяют
содержание примеси. Для повышения точности возможно
использование способа внутреннего стандарта.
УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
В методике рекомендуется указывать следующие условия
анализа:
— размеры хроматографической колонки и
материал, из которого она изготовлена;
~ тип неподвижной фазы и при необходимости
ее коммерческую марку;
~ размер частиц неподвижной фазы;
~ при использовании предколонки те же сведения
указываются для н<=е'
~ температуру колонки,
~ скорость потока и состав подвижной фазы;
~ в случае использования градиента - программу
его изменения;
~ тип детектора.
Пригодность хроматографической системы.
Результаты анализа считаются достоверными, если
выполняются требования теста «Проверка пригод-
H O i - T n хроматографнчро ой системы), Данный тест
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ СО СВОБОДНОЙ ИЛИ
С ПОДВИЖНОЙ ГРАНИЦЕЙ
Данный метод используется, главным образом, для определения
электрофоретической подвижности, являющейся
экспериментальной непосредственно измеряемой
и воспроизводимой характеристикой веществ.
Обычно этот метод применяют для веществ с высокой
относительной молекулярной массой, обладающих
низкой способностью к диффузии. На начальной стадии
местоположение границы определяют такими
физическими методами, как рефрактометрия и кон-
дуктометрия. После приложения заданного электрического
поля в течение точно измеренного времени
отмечают новые границы и их относительное местоположение.
Следует подобрать такие условия, при
которых возможно определение числа границ, соответствующих
количеству присутствующих компонентов.
ЗОННЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА НОСИТЕЛЕ
Для данного метода требуются только малые количества
вещества.
Природа носителя, такого как, например, бумага, агаровый
гель, ацетатцеллюлоза, крахмал, агароза, ме-
такриламид, смешанный гель, вносит дополнительные
факторы, влияющие на подвижность:
a) из-за наличия каналов в носителе кажущееся расстояние,
пройденное веществом, меньше истинного
расстояния;
b) некоторые носители электрически не нейтральны.
При использовании в качестве среды стационарной
фазы возможен, иногда, значительный рост электро-
эндоосмотического потока;
c) незначительное нагревание из-за теплового действия
тока может вызвать некоторое испарение жидкости
из среды носителя, который, благодаря капиллярности,
заставляет раствор двигаться от краев к
центру, что приводит к постепенному увеличению ионной
силы раствора.
>·> ^мр>*у
Таким образом, скорость движения зависит от четырех
главных факторов: подвижности заряженных частиц,
электро-эндоосмотического потока, потока испарения
и напряженности поля. Следовательно, необходимо
работать в точно определенных экспериментальных
условиях и использовать, по возможности,
стандартные вещества.
Прибор для электрофореза состоит из:
- источника постоянного тока, напряжение которого
можно контролировать и, желательно, стабилизировать;
- электрофоретической камеры. Обычно она представляет
собой прямоугольную камеру, изготовленную
из стекла или жесткого пластика. Камера состоит
из двух изолированных отделений, анодного и катодного,
заполненных электролитом. В каждое отделение
погружают электрод, например, платиновый или
графитовый. Их присоединяют изолированной цепью
к соответствующим клеммам источника тока для образования
анода и катода. Уровень жидкости в обоих
отделениях должен быть одинаковым для предотвращения
сифонного сброса.
Электрофоретическая кам.ера снабжена герметической
крышкой, которая поддерживает влажно - насыщенную
атмосферу . течение всего процесса и уменьшает
испарение растворителя. При снятии крышки
срабатывает механизм безопасного отключения электроэнергии.
Если напряжение, измеренное поперек
полосы, превышает 10 В, то следует охладить носитель.
- устройства носителей:
Электрофорез на полоске. Каждый конец несущей
полоски, предварительно смоченной тем же электролитом,
погружают в электродную камеру, натягивают
и закрепляют соответствующим держателем для предотвращения
диффузии электролита. В качестве держателя
может быть использована горизонтальная рамка,
обратная V-образная подставка или однородная
поверхность с точками контакта через определенные
интервалы.
Гель-электрофорез. Прибор состоит, по существу, из
стеклянной пластинки (например, предметное стекло
микроскопа), на всей поверхности которой осажден
прочно прикрепленный слой геля одинаковой толщины.
Связь между гелем и электролитом осуществляется
различными путями в зависимости от типа используемого
прибора. Следует принять меры для предупреждения
конденсации влаги или высыхания твердого
слоя.
- измерительного прибора или регистрирующего средства.
Методика. Раствор электролита помещают в электродные
отделения. Носитель, импрегнированный раствором
электролита, помещают в электрофоретическую
ячейку в соответствии с условиями, описанными для
используемого типа прибора. Устанавливают стартовую
линию и наносят образец. Подают электрический
ток в течение указанного времени. После отключения
электрического тока, носитель вынимают из ячейки,
сушат и проявляют.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КОЛОНКАХ
С ПОЛИАКРИЛАМИДНЫМ ГЕЛЕМ
При электрофорезе на колонках с полиакриломид-
ным гелем неподвижной фазой является гель, приготовленный
из смеси акриламида и ., N -метиленби-
сакриламида. Колонку с гелем получают в трубках
длиной 7.5 см и внутренним диаметром 0.5 см, используя
один и тот же раствор.
Прибор. Прибор состоит из двух, вертикально установленных
друг над другом, резервуаров с буферными
растворами. Резервуары изготавливают из подходящего
материала, такого как, например, полиметил-
метакрилат. Каждый резервуар снабжен платиновым
электродом. Электроды присоединяют к источнику тока,
что позволяет проводить эксперимент либо при постоянном
электрическом токе, либо при постоянном
напряжении. В основании верхнего резервуара имеется
определенное число держалок, равноудаленных
от электрода.
Методика. Обычно перед полимеризацией растворы
дегазируют, а полученные гели используют сразу после
приготовления. Смесь для получения геля готовят в
соответствии с ранее приведенным описанием. Смесь
наливают в стеклянные трубки с притертыми у основания
пробками до одинакового уровня, не достигая
около 1 см от верхнего края трубки и избегая образования
пузырьков воздуха. На смесь геля наслаивают
воду Р, чтобы исключить попадание воздуха, и оставляют
для затвердевания. Гелеобразование обычно
требует около 30 мин и завершается, когда между
гелем и водным слоем появляется четкая граница
раздела. Удаляют водный слой. Нижний резервуар
заполняют указанным буферным раствором. Колонки
открывают и устанавливают в держатели верхнего
резервуара таким образом, чтобы дно колонок погружалось
в буферный раствор нижнего резервуара.
Колонки осторожно заполняют указанным буферным
раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы,
содержащие маркерный краситель, уплотняют
путем растворения в них, например, сахарозы Р. Полученные
растворы наслаивают на поверхность геля,
используя для каждого раствора отдельную колонку.
Верхний резервуар наполняют тем же буферным раствором.
Подключают электроды к источнику тока,
электрофорез проводят при указанной температуре
и указанном постоянном напряжении или постоянном
токе. Источник питания отключают, когда маркерный
краситель почти переходит в нижний резервуар. Каждую
колонку сразу же вынимают из прибора и выдавливают
гель. Определяют положение полос на
электрофореграмме в соответствии с описанием в
частной статье.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
С НАТРИЕМ ДОДЕ ЦИ Л СУЛЬФАТА (ДСН-ПАГ)
Область применения. Электрофорез в полиакри-
ламидном геле применяют для качественной характеристики
белков в биологических препаратах, для контроля
их чистоты и количественных определений.
Цель. Аналитический гель-электрофорез является
подходящим методом, с помощью которого идентифицируют
и определяют однородность белков в лекарственных
средствах. Метод обычно используют
для оценки молекулярных масс белковых субъединиц,
а также для определения их состава в очищенных
белках.
Готовые гели и реагенты широко доступны на рынке и
могут быть использованы вместо описанных в данной
статье при условии, что они дают эквивалентные результаты
и отвечают требованиям, приведенным в
разделе «Валидация испытаний».
ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ
Ситовые свойства полиакриламидных гелей обусловлены
трехмерной сеткой волокон или пор, образующихся
благодаря бифункциональным бисакриламид-
ным поперечным связям между соседними полиакри-
ламидными цепями. Процесс полимеризации катализирует
система, генерирующая свободные радикалы,
которая состоит из аммония персульфата и тетраме-
тилэтиленди амина.
При увеличении в геле концентрации акриламида в
геле, эффективность размера пор уменьшается. Эффективность
размера пор геля определяется его ситовыми
свойствами, то есть, его сопротивлением миграции
макромолекул. Допускаются только определенные
пределы концентрации акриламида. При высоких
концентрациях акриламида гели намного легче разрушаются
и труднее обрабатываются. При уменьшении
размера пор геля уменьшается и скорость движения
белка через гель. Регулируя размеры пор геля
путем подбора концентрации акриламида, можно
повысить эффективность разделения белка. Таким
образом, данный гель характеризуется соответствующим
составом акриламида и бисакриламида.
Кроме состава геля, важной составляющей электро-
форетической подвижности является строения белка.
В случае белков электрофоретическоя подвижность
зависит от значения рК заряженных групп и размера
молекулы. На нее влияют тип, концентрация и рН буфера,
температура и напряженность поля, а также
природа носителя.
ДЕНА ТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Данный метод является примером анализа мономерных
полипептидов с молекулярной массой от
14 ООО до 100 ООО дальтон. Можно расширить эту
область молекулярных масс применением различных
методов (например, используя градиентные гели, специфические
буферные системы), но эти приемы не
рассматриваются в данной статье.
Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном
геле с применением натрия додецилсульфата (ДСН-
ПАГ) является наиболее общим методом электрофореза,
применяемого для оценки фармацевтического
качества белковых продуктов. Обычно, электрофорез
белков проводят в полиакриламидных гелях в условиях,
обеспечивающих диссоциацию белков на отдельные
полипепгид.тые субъединицы и минимальную
их агрегацию. Перед нанесением на гель белки, как
правило, подвергают диссоциации, нагревая их с
сильным, анионным детергентом натрия додецилсуль-
фатом (ДСН). Денатурированные полипептиды, связываясь
с ДСН, приобретают отрицательный заряд с
постоянным отношением заряда к массе, независимо
от типа белка. Вследствие того, что количество
связанного ДСН почти всегда пропорционально молекулярной
массе полипептида и не зависит от его
последовательности, ДНС - полипептидные комплексы
мигрируют в полиакриламидном, геле с подвиж-
ностями, зависящими от размера полипептида.
Электрофоретические подвижности полученных детергент
- полипептидных комплексов находятся в такой
же функциональной зависимости от их молекулярных
масс. Как и предполагалось, миграция ДСН -
комплексов происходит к аноду, причем комплексы с
низкими молекулярными массами мигрируют быстрее,
чем с высокими молекулярными массами. Следовательно,
молекулярная масса белка может быть оценена
по его относительной подвижности в калиброванном
ДСН-ПАГ. Нахождение одиночной полосы в
таком геле является критерием чистоты.
Однако, модификация полипептидного остова путем
N- или О- гликозилирования оказывает значительное
воздействие на кажущуюся молекулярную массу
белка поскольку натрия додецилсульфот не связывается
с карбогидратным компонентом так, как с полипептидным.
Поэтому постоянное отношение заряда к
массе не сохраняется. Кажущаяся молекулярная месса
белков, подверженных посттрансляционным модификациям,
не является истинным отражением массы
полипептидной цепи.
Восстановительные условия. Полипептидные
субъединицы и трехмерная структура белка поддерживаются,
в основном, благодаря наличию дисуль-
фидных связей. Целью ДСН -ПАГ анализа в восстановительных
условиях является разрушение этой структуры
путем восстановления дисульфидных связей. При
обработке 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом
(ДТТ) происходит полная денатурация и диссоциация
белков, приводящих к разворачиванию полипептид-
ного остова с последующим комплексообразовани-
ем с натрия додецилсульфатом. В этих условиях молекулярную
массу полипептидных субъединиц можно
рассчитать по линейной регрессии в присутствии
подходящих молекулярно-массовых стандартов.
Невосстановительные условия. Для некоторых
анализов полная диссоциация белка на пептидные
субъединицы не желательна. Если белок не обрабатывать
восстанавливающими агентами, такими как 2-
меркаптоэтанол или ДТТ, то дисульфидные ковалент-
ные связи остаются неповрежденными, сохраняя при
этом его олигомерные формы. Олигомерные ДСН -
белок комплексы мигрируют более медленно, чем их
ДСН - полипептидные единицы. Кроме того, невосстановленные
белки не могут быть полностью насыщены
ДСН и, следовательно, не могут связывать детергент
в постоянном массовом отношении. Поэтому моле-
кулярно-массовые определения токих молекул при
помощи метода ДСН - ПАГ менее точны, чем анализ
полностью денатурированных полипептидов, так как
для адекватных сравнений необходимо наличие стандартов,
имеющих такую же конфигурацию, что и неизвестные
белки. Однако окрашивание единственной
полосы в таком геле является критерием чистоты.
ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ
С ПРЕРЫВИСТОЙ БУФЕРНОЙ СИСТЕМОЙ
Наиболее широко применяемый электрофоретичес-
кий метод для характеристики сложных смесей белков
включает использование прерывистой буферной системы,
состоящей из двух различных гелей: разрешающего
или разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего
(верхнего) геля. Гели отличаются пористостью,
значением рН и ионной силой. Кроме того, в
гелях и электродных буферах используются ионы с
разной подвижностью. Буферная дискретность приводит
к концентрированию большого объема образцов
в концентрирующем геле, что приводит к улучшению
разрешения. При прохождении тока через испытуемый
раствор напряжение падает, что приводит
к переносу белков в концентрирующий гель. Ионы
глицината из электродного буфера следуют за белками
в концентрирующий гель. Быстро образуется область
подвижной границы с высокоподвижными хлорид-
ионами впереди и относительно медленными гли-
цинат-ионами сзади. Возникает локализованный высоковольтный
градиент между фронтами лидирующих
и отстающих ионов, приводящий к образованию тонкой
зоны ДСН - протеин комплексов (концентрирование)
и их миграции между фазами хлорида и глицината.
В широких пределах, независимо от высоты
нанесенного образца, все ДСН - белки конденсируются
в очень узкую область и проникают в разрешающий
гель в виде четко обозначенной, тонкой зоны с
высокой плотностью белка. Крупнопористый концентрирующий
гель не препятствует миграции большин-
ства белков и служит, главным образом, антиконвекционной
средой. На поверхности раздела концентрирующего
и разрешающего гелей движение белков
резко замедляется, что обусловлено ограничивающими
размерами пор разрешающего геля. Иногда в разрешающем
геле движение белков продолжает замедляться
из-за ситовых свойств матрицы.
Ионы глицината догоняют белки, которые затем движутся
в пространстве постоянного рН, образованного
трис(гидроксиметил)аминометаном и глицином.
Молекулярно-ситовые свойства матрицы разделяют
ДСН - полипептидные комплексы по их молекулярным
массам.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВЕРТИКАЛЬНЫХ ПРЕРЫВИСТЫХ
БУФЕРНЫХ ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ
Сборка кассет, формирующих гель. Две стеклянные
пластины (например, размером 10 см . 8 см),
политетрафторэтиленовый гребень, две прокладки и
силиконовые трубки (например, диаметром 0.6 мм .
35 см) моют мягким детергентом и промывают обильно
водой, а затем сушат бумажной салфеткой или
тканью. Прокладки и трубки смазывают несиликоновой
смазкой. Прокладки укладывают вдоль каждой
из двух коротких сторон стеклянной пластины на расстоянии
2 мм от краев и 2 мм от края длинной
стороны, соответствующей нижней части геля. Используя
одну прокладку как основу, укладывают трубку на
стеклянную пластину. Осторожно сворачивают трубку
до нижней части прокладки и протягивают ее вдоль
длинной стороны стеклянной пластины. Придерживая
одним пальцем трубку вдоль длинной стороны, снова
сворачивают ее и укладывают на короткие стороны
стеклянной пластины, используя прокладку в качестве
направляющей. Накрывают второй стеклянной пластиной,
выравнивая по одной линии, и сильно сжимают
форму руками. На каждой из двух коротких сторон
матрицы закрепляют по два зажима, а по длинной
стороне осторожно устанавливают четыре зажима,
формируя таким образом основание матрицы.
Следует убедиться, что трубка, проложенная вдоль
края стеклянных пластинок не выдавлена при закреплении
зажимов. Форма готова для заливки геля.
Приготовление геля. В прерывистый буферный ДСН
полиакриламидный гель рекомендуют сначала налить
разрешающий гель, дать ему затвердеть, а затем наливают
концентрирующий гель, поскольку буфер и состав
двух гелей в акриламиде-бисакриламиде рН различен.
Приготовление разрешающего геля. В конической
колбе готовят соответствующий объем раствора, содержащего
необходимую концентрацию акриламида
для приготовления разрешающего геля, используя
значения, приведенные в таблице 2.2.31.-1. Компоненты
смешивают в указанном порядке. При необходимости,
перед добавлением раствора аммония персульфата
и тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД) раствор
фильтруют под вакуумом через ацетатцеллюлозную
мембрану (диаметр пор 0.45 мкм). Раствор держат
под вакуумом, вращая фильтрующее устройство до
прекращения образования в растворе пузырьков.
Добавляют необходимое количество раствора аммония
персульфата и ТЕМЕД в соответствии с указаниями
в таблице 2.2.31.-1., взбалтывают и немедленно
выливают в зазор между двумя стеклянными пластинками
матрицы. Оставляют пространство, достаточное
для концентрирующего геля (длина зубьев гребня
плюс 1 см). Используя заостренную стеклянную пипетку,
осторожно наслаивают насыщенный водою
раствор изобутанола. Оставляют гель в вертикальном
положении при комнатной температуре для полимеризации.
Приготовление концентрирующего геля. После завершения
полимеризации (около 30 мин), сливают изобу-
танол и промывают верхнюю поверхность геля несколько
раз водой, для удаления нанесенного изобутанола
и излишков неполимеризованного акриламида.
По возможности с верхней поверхности геля сливают
воду, а затем удаляют остатки воды кончиком
бумажной салфетки.
В конической колбе готовят соответствующий объем
раствора, содержащего требуемую концентрацию
акриламида, используя значения, приведенные в таблице
2.2.31.-2. Компоненты смешивают в указанном
порядке. При необходимости, перед добавлением
раствора аммония персульфата и ТЕМЕД, раствор
фильтруют под вакуумом через ацетатцеллюлозную
мембрану (диаметр пор 0.45 мкм); держат раствор
под вакуумом, вращая фильтрационное устройство до
прекращения образования в растворе пузырьков.
Добавляют необходимое количество раствора аммония
персульфата и ТЕМЕД в соответствии с указаниями
в таблице 2.2.31.-2., взбалтывают и немедленно
выливают в зазор между двумя стеклянными пластинками
матрицы прямо на поверхность полимеризован-
ного разрешающего геля. Сразу же в концентрирующий
гель осторожно, не допуская поглощения воздуха,
вставляют чистый политетрафторэтиленовый гребень.
Добавляют концентрирующий гель для полного
заполнения пространства гребня. Оставляют гель в
вертикальном положении при комнатной температуре
для полимеризации.
Установка геля в прибор для электрофореза
и электрофоретическое разделение. После завершения
полимеризации (около 30 мин) осторожно
удаляют политетрафторэтиленовый гребень. Сразу же
промывают стенки водой или рабочим буферным раствором
в системе ДСН - ПАТдпя удаления неполи-
меризованного акриламида. При необходимости, поправляют
выступ концентрирующего геля тупой подкожной
иглой, надетой на шприц. Снимают зажимы с
одной короткой стороны, осторожно вытаскивая трубку,
а затем возвращают их на место. Аналогичным
образом поступают и с другой короткой стороной.
Удаляют трубку с нижней части геля. Гель помещают
в прибор для электрофореза. Верхний и нижний резервуары
заполняют буферным раствором для электрофореза.
С помощью изогнутой подкожной иглы,
надетой на шприц, удаляют пузырьки, образующиеся
в нижней части геля между стеклянными пластинками.
Не следует проводить предварительное испытание
геля до нанесения образцов, так как это приводит к
нарушению дискретности буферной системы. Перед
нанесением образца осторожно споласкивают зазор
рабочим буфером P для электрофореза в системе
ДСН-ПАГ. Готовят испытуемые растворы и растворы
сравнения в рекомендуемых буферах и обрабатывают
их в соответствии с указаниями в частной статье.
Наносят необходимый объем каждого раствора в
бороздки концентрирующего геля. Начинают электрофорез
в условиях, рекомендованных в инструкции к
прибору. Производители оборудования для ДСН-ПАГ
электрофореза могут поставлять гели с различной
площадью поверхности и толщиной.
Таблица 2.2.31.-1. - Приготовление разрешающего геля
Компоненты раствора Объемы компонента (мл) на объем матрицы геля
5 мл 10 мл 15 мл 20 мл 25 мл 30 мл 40 мл 50 мл
6 % акриламид
Вода P 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5
Раствор акриламида 1,1 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0
1.5 M Трис (рН 8.8р> 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
Раствор 100 г/л ДСН а 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
Раствор 100 г/л АПС ю 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
ТЕМЕД .51 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04
8% акриламид
Вода P 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2
Раствор акриламида 1,1 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.3
1.5 M Трис (РН 8.8) й 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
Раствор 100 г/л ДСН <31 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
Раствор 100 г/л АПС ^ 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
ТЕМЕД га 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03
10% акриламид
Вода P 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8
Раствор акриламида 1,1 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7
1.5 M Трис (рН 8.8) и 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
Раствор 100 г/л ДСН 131 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
Раствор 100 г/л АПС 1 4I 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
ТЕМЕД .51 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
12% акриламид
Вода P 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5
Раствор акриламида 111 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.0
1.5 M Трис (рН 8.8) '2| 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
Раствор 100 г/л ДСН (3I 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
Раствор 100 г/л АПС w 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
ТЕМЕД '5> 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
14% акриламид
Вода P 1.4 2.7 3.9 5.3 6.6 8.0 10.6 13.8
Раствор акриламида "! 2.3 4.6 7.0 9.3 11.6 13.9 18.6 23.2
1.5 M Трис (рН 8.8) 121 1.2 2.5 3.6 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
Раствор 100 г/л ДСН ^ 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
Раствор 100 г/л АПС W 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
ТЕМЕД и 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
15% акриламид
Вода P 1.1 I 2 з ~ 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5
Раствор акриламида 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 20.0 25.0
1.5 M Трис (рН 8.8) и 1.3 2.5 3.8 5.8 6.3 7.5 10.0 12.5
Раствор 100'г/л ДСН 131 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
Раствор 100 г/л АПС | 4 ) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
ТЕМЕД 155 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
0 1 Раствор акриламида: 30% раствор акриламида-бисакриламида (29:1) Р.
и 1.5 M Трис (рН 8.8): 1.5 M буферный раствор трис-гидрохлорида с рН 8.8 Р.
i 3 ] Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата Р.
{ М Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата Р. Аммоний персульфат доставляет свободные радикалы,
ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата медленно разлагается
следует еженедельно готовить свежие растворы.
151 ТЕМЕД: тетраметилэтилендиамин Р.
Таблица 2.2.31.-2. Приготовление концентрирующего геля
Компоненты раствора Объемы компонента (мл) на объем матрицы геля
1 мл 2 мл 3 мл 4 мл 5 мл 6 мл 8 мл ТО мл
Вода P 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8
Раствор акриламида 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7
1.0 M Трис (рН 6.8 р 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25
Раствор 100 г/л ДСН 131 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
Раствор 100 г/л АПС W 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
ТЕМЕД ! 51 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01
Раствор акриламида. 30% раствор акриламида-бисакриламида (29:1) Р.
121 1.0 M Трис (рН 6.8): / M буферный раствор трис-гидрохлорида с рН 6.8 Р.
131 Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата Р.
.> Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата Р. Аммоний персульфат доставляет свободные радикалы,
ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата медленно разлагается
следует еженедельно готовить свежие растворы.
|5) ТЕМЕД: тетраметилэтилендиамин Р.
Для достижения оптимального разделения следует варьировать
продолжительность проведения электрофореза
и силу тока /напряжение в соответствии с инструкцией
к прибору. Контролируют продвижение фронта
красителя в разрешающий гель. Электрофорез прекращают,
когда краситель достигает нижней части геля.
Кассету геля вынимают из прибора, снимают стеклянные
пластинки, удаляют прокладки, отрезают и отбрасывают
концентрирующий гель и немедленно приступают
к окрашиванию оставшегося геля.
ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ В ГЕЛЯХ
Наиболее общим методом окрашивания белков, позволяющего
обнаруживать от 1 мкг до 10 мкг белка
в одной полосе, является Кумаси окрашивание. Серебряное
окрашивание является наиболее чувствительным
методом для окрашивания белков в геле. При
этом могут быть обнаружены полосы, содержащие
от 10 нг до 100 нг белка.
Все стадии окрашивания геля проводят при комнатной
температуре в подходящем сосуде при мягком
встряхивнии (например, на орбитальной платформе
вибратора). При окрашивании геля следует надеть
перчатки, так как на нем остаются отпечатки пальцев.
Кумаси окрашивание. Погружают гель в большой
избыток Кумаси окрашивающего раствора Pw оставляют
в покое не менее чем на 1 час. Затем окрашивающий
раствор сливают.
Гель промывают большим количеством промывающего
раствора Р. Промывающий раствор меняют до тех
пор, пока окрашенные белковые полосы не будут
четко различимыми на светлом фоне. Чем тщательнее
промывают гель, тем меньшее количество белка
может быть обнаружено данным методом. Промывание
можно ускорить, добавив в промывающий раствор
нескольких граммов анионообменной смолы или маленькую
губку, смоченную промывающим раствором
P
ПРИМЕЧАНИЕ: кислотно-спиртовые растворы, применяемые
в данной методике, не полностью фиксируют
белки в геле. Это может привести к потере некоторых
низкомолекулярных белков в процессе окрашивания
и промывания тонких гелей. Стойкая фиксация
достигается путем помещения геля в смесь трих-
лоруксусная кислота P - метанол P - вода Pl.:4:5) на
I час перед погружением в Кумаси красящий раствор
Р.
Серебряное окрашивание. Гель погружают в
большой избыток фиксирующего раствора Pw оставляют
на 1 час. Фиксирующий раствор сливают, затем
гель заливают свежеприготовленным фиксирующим
раствором и выдерживают в нем не менее чем
1 час или, по возможности, оставляют на ночь. Фиксирующий
раствор сливают, гель промывают большим
избытком воды PB течение 1 час. Гель выдерживают
в 1 % растворе (об/об) глутарового альдегида
P B течение 1 5 мин. Гель дважды промывают большим
избытком воды P в течение 1 5 мин. Затем гель оставляют
в свежеприготовленном реагенте серебра
нитрата P в темном месте на 1 5 мин. Гель трижды
пром.ывают большим количеством воды P в течение
1 5 мин. Гель погружают в проявляющий раствор P
приблизительно на 1 мин до появления удовлетворительного
окрашивания. Проявление прекращают, помещая
гель в закрепляющий раствор P на 15 мин.
Затем гель ополаскивают водой Р.
ВЫСУШИВАНИЕ ОКРАШЕННЫХ
ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ
В зависимости от используемого метода окрашивания
гели обрабатывают различными способами. При
Кумаси окрашивании гели, после стадии промывания,
оставляют в растворе 100 г/л глицерина P не менее,
чем на 2 час (возможна инкубация на ночь). При
серебряном окрашивании гель на конечной стадии
дополнительно ополаскивают в растворе 20 г/л глицерина
P в течение 5 мин.
Два листа пористой целлюлозной пленки погружают
в воду P и выдерживают в течение 5 - 1 0 мин. Один из
листов помещают на сушильную раму. Осторожно
поднимают гель и переносят его на целлюлозную пленку,
удаляют поглощенные пузырьки воздуха и наливают
несколько миллилитров воды P по краям геля. Затем
накрывают вторым листом и удаляют пузырьки воздуха,
завершая таким образом сборку сушильной рамы.
Раму помещают в сушильный шкаф или оставляют при
комнатной температуре до высушивания.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ
Молекулярные массы белков определяют путем сравнения
их подвижностей с белками-маркерами с известной
молекулярной массой. Смеси белков с точно
известными молекулярными массами, приготовленные
для однородного окрашивания, пригодны для калибровки
гелей. Они применимы для разного интервала
молекулярных масс. Концентрированные растворы
белков с известной молекулярной массой разбавляют
в соответствующих буферах и наносят на тот же
гель, что и испытуемый белок.
Сразу после проведения электрофореза, отмечают
положение электрофоретического фронта красителя
бромфенолового синего. Это можно сделать путем
нанесения насечек по краям геля или введением иглы,
смоченной тушью, в гель у фронта красителя. После
окрашивания, измеряют путь, пройденный каждой
белковой полосой (маркерных и неизвестных) от края
разрешающего геля. Путь, пройденный каждым белком,
делят на путь, пройденный фронтом красителя.
Полученные таким образом значения называют относительной
подвижностью белков (относительно
фронта красителя) и условно обозначают R1. Строят
график зависимости логарифма относительных молекулярных
масс /yW/белковых стандартов от значений
R.. Обычно графики имеют слегка сигмовидную форму.
Неизвестные молекулярные массы могут быть
оценены путем анализа линейной регрессии или интерполяцией
кривых log Mt от R в том случае, если
полученные значения для неизвестных образцов расположены
в линейной части кривой.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ
Методику испытаний считают достоверной, если молекулярные
массы белков-маркеров распределены
вдоль 8 0 % длины геля и охватывают требуемую область
разделения (т.е., области, охватывающие ве-
щество и его димер, или вещество и его родственные
примеси). Разделение белковых полос показывает
линейную зависимость логарифма молекулярной массы
от Rf Дополнительные требования к валидации испытуемых
растворов при испытании могут быть детально
изложены в частных статьях.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ПРИМЕСЕЙ
Поскольку в частной статье содержание примесей
регламентировано, то растворы сравнения, соответствующие
уровню примесей, должны быть приготовлены
путем разбавления испытуемых растворов. Например,
при регламентируемой норме содержания
примесей 5 % для приготовления раствора сравнения
следует испытуемый раствор разбавить в соотношении
1:20. На электрофореграмме, полученной для
испытуемого раствора, полоса примеси (любая полоса,
кроме основной полосы активного вещества)
не должна быть интенсивнее основной полосы на электрофореграмме,
полученной для раствора сравнения.
Для валидированной методики содержание примесей
может быть количественно определено методом внутренней
нормализации по отношению к основной полосе
с использованием интегрирующего денситометра.
При валидации методики должна быть подтверждена
линейность.
пературном интервале, указанном в частной статье;
е) «под высоким вакуумом»: высушивание над
фосфора(У) оксидом Япри давлении не более 0.1 кПа
и температуре, указанной в частной статье.
Если указаны иные условия, используемая методика
полностью описывается в частной статье.
Допускается использование анализатора влажности
при условиях, указанных в частной статье.
2.2.35. ОСМОЛЯЛЬНОСТЬ
Осмоляльность - это показатель, позволяющий оценить
суммарный вклад различных растворенных веществ
в осмотическое давление раствора.. . и -
ближенный расчет осмоляльности . водного раствора
проводят по формуле:
2.2.32. ПОТЕРЯ В МАССЕ ПРИ
ВЫСУШИВАНИИ
Определение потери в массе при высушивании проводят
одним из приведенных способов и выражают
в процентах (м/м).
Методика. Указанное в частной статье количество
испытуемого вещества помещают во взвешенный
бюкс, предварительно высушенный в условиях,
описанных для испытуемого вещества. Вещество сушат
до постоянной массы или в течение времени,
указанного в частной статье, одним из следующих
способов:
a) «в эксикаторе»: высушивание проводят над
фосфора/V) оксидом /°при атмосферном давлении
и комнатной темперотуре;
b) «в вакууме»: высушивание проводят над
.......(.) оксидом P при давлении от 1.5 кПа
до 2.5 кПа и комнатной температуре;
c) « я вакууме в пределах указанного температурного
интервала»: высушивание над фосфора/У/ оксидом
P при давлении от 1.5 кПа до 2.5 кПа и
температуре, указанной в частной статье;
d) «в пределах указанного температурного интервала
»: высушивание в сушильном шкафу при тем-
. = ....,
где
. - суммарное число ионов, образующихся из одной
молекулы растворенного вещества в результате
диссоциации. В случае, если растворенное вещество
не диссоциирует на ионы, . = 1;
т - моляльность раствора, т.е. число молей растворенного
вещества на килограмм растворителя;
. - моляльный осмотический коэффициент, учитывающий
взаимодействие между ионами противоположного
знака в растворе и зависящий от величины
т. По мере усложнения состава раствора усложняется
и определение величины Ф.
Единицей осмоляльности является осмоль на килограмм
растворителя (осмоль/кг), но на практике
обычно используется единица миллиосмоль на килограмм
растворителя (мосмоль/кг).
Осмоляльность определяют по понижению температуры
замерзания раствора при отсутствии других
указаний в частной статье. Зависимость между
осмоляльностью и понижением температуры замерзания
.. выражают соотношением:
AT
Im ~ — х 1000 мосмоль/кг
1.86
Прибор. Составными частями прибора (осмометра)
являются:
- приспособление для охлаждения сосуда с измерительной
кюветой;
- система для измерения температуры, состоящая
из чувствительного к температуре сопротивления
(термистора) с соответствующим устройством
для измерения тока или разности потенциалов. Измерительное
устройство может быть градуировано
в градусах понижения температуры или непосредственно
в единицах осмоляльности;
- как правило, приспособление для перемешивания
образца.
Методика. Готовят стандартные растворы в соответствии
с таблицей 2.2.35.-1. Устанавливают нулевое
значение на шкале прибора, используя воду Р.
Проводят калибровку прибора, используя стандартные
растворы: помещают от 50 мкл до 250 мкл стандартного
раствора в измерительную ячейку и начинают
охлаждение системы. Чтобы предотвратить переохлаждение,
измерительное устройство, как правило,
программируют на работу при температурах
более низких, чем ожидаемое криоскопическое понижение
температуры.
Соответствующее устройство указывает на достижение
равновесия. Перед каждым измерением ячейку
ополаскивают соответствующим стандартным раствором.
Те же операции проводят с испытуемым раствором.
При этом перед каждым измерением кювету ополаскивают
испытуемым раствором. Результаты либо непосредственно
определяют по шкале прибора, либо
рассчитывают по измеренному понижению температуры
замерзания. Результаты считают достоверными,
если полученное значение осмоляльности испытуемого
раствора не выходит за пределы значений осмоляльности
двух стандартных растворов, использованных
для калибровки.
Для выражения осмотических концентраций раствора
используют термины: осмоляльность и осмолярная концентрация*.
Данные показатели близки и отличаются друг от друга
только различным способом выражения концентрации
растворов - моляльной и молярной.
Осмоляльность - количество осмолей на 1 кг растворителя;
Осмолярная концентрация - количество осмолей на
1 л раствора.
Для идеальных растворов масса осмоля, в граммах,
Таблица 2.2.35.-1
Стандартные растворы для калибровки осмометра
Масса
натрия хлорида Р,
в граммах на
килограмм воды P
Фактическая
осмоляльность
(мосмоль/кг)
Теоретическая
осмоляльность
идеального
раствора
(мосмоль/кг)
Моляльный
осмотический
коэффициент
Криоскопическое
понижение
температуры
( 0C)
3.087 100 105.67 0.9463 0.186
6.260 200 214.20 0.9337 0.372
9.463 300 323.83 0.9264 0.558
12.684 400 434.07 0.9215 0.744
15.916 500 544.66 0.9180 0.930
19.147 600 655.24 0.9157 1.116
22.380 700 765,86 0.9140 1.302
* Термин осмолярная концентрация не рекомендуется к употреблению в современной химической терминологии.
представляет собой отношение грамм-молекулярной
массы вещества к числу частиц или ионов, образующихся
при его растворении.
Для разбавленных растворов, близких к идеальным,
осмоляльность и осмолярная концентрация могут быть
рассчитаны теоретически.
Осмолярная концентрация идеальных растворов может
быть рассчитана по формуле:
где
См - количество растворенного вещества в граммах
на литр;
. - число структурных единиц, образующихся при
растворении одной молекулы вещества.
Единицей осмолярности является осмоль на литр раствора
(осмоль/л, осмоль/дм3 в системе СИ), но на
практике обычно используется единица миллиосмоль
на литр раствора (мосмоль/л, мосмоль/дм3).
При повышении концентрации раствора взаимодействие
между частицами вещества возрастает и реальная
осмолярная концентрация понижается по сравнению
с осмолярной концентрацией идеального раствора.
Теоретический расчет осмолярной концентрации растворов
веществ с большой молекулярной массой (например,
белковых гидролизатов) и высококонцентрированных
растворов невозможен. В таких случаях определяют
осмоляльность экспериментальным путем по
понижению температуры замерзания раствора или
по понижению давления пара над раствором. Понижение
температуры замерзания на 1.86 0C и понижение
давления пара на 0.3 мм рт.ст. (44 Па) при
температуре 25 0C соответствует 1 осмолю на килограмм
воды.
Растворы, равные по осмоляльности 0.9 % раствору
натрия хлорида, называют изотоническими.
Наряду с прибором, описанным выше, для определения
осмоляльности могут использоваться также осмометры,
основанные на измерении давления пара над
раствором. Они требуют малого объема вводимой
пробы (около 5 мкл), при этом воспроизводимость и
правильность определения сравнима со значениями,
полученными на криоскопических приборах.
В осмометрах, основанных на измерении понижения
температуры замерзания, объем вводимой пробы
образца можно варьировать.
Значение осмоляльности (осмолярной концентрации)
необходимо указывать на этикетках инфузионных растворов.
ТИТРОВАНИЕ В НЕВОДНЫХ
РАСТВОРИТЕЛЯХ
Метод кислотно-основного титрования в неводных
растворителях применяется для количественного определения
веществ, представляющих собой кислоты,
основания или соли, титрование которых в воде затруднено
или невозможно из-за слабых кислотно-основных
свойств или малой растворимости.
В неводных растворителях резко меняются кислотно-
основные свойства различных веществ. В зависимости
от растворителя одно и то же вещество может
быть кислотой, основанием или вообще не проявлять
кислотно-основных свойств. Применение различных
растворителей позволяет управлять кислотно-основными
свойствами веществ.
Выбор растворителя осуществляется на основании
величин констант титрования K7 или их отрицательных
логарифмов рК,. Величина рКт является критерием
возможности и точности титрования. Чем больше
эта величина, тем лучше условия титрования. Константа
титрования определяется двумя основными величинами:
константой диссоциации растворенного вещества
[К -для кислот, К, - для оснований) и константой растворителя
- ионным произведением среды [К).
- Для титрования кислот:
К.
K1 ~ или рК7=рК-рКА;
- Для титрования оснований:
К
Кг= или рК,=рК~pKRv\m рК,=рКА;
КЕ
- Для титрования смеси двух кислот:
КА,2,
КТ~ или ..,-..^-..^;
К» (II
- Для титрования смеси двух оснований:
Kr = - - и л и РКТ
=РКщРкщ
Индексы 1 и 2 обозначают порядок нейтрализации.
Значения величин ионных произведений для ряда растворителей
и константы диссоциации кислот и оснований
в воде и различных неводных растворителях
приведены в таблицах 2, 3, 4. Эти таблицы позволяют
быстро определять рКт. Задачу выбора растворителя
помогает решить также линейная зависимость рК,
кислот и оснований, принадлежащих к одной группе
химических соединений, в воде и неводных растворителях.
Это позволяет определять рКт кислот и оснований
в неводных растворителях, если известны их рКт в
воде.
Как кислоты можно титровать: карбоновые кислоты,
фенолы, барбитураты, сульфамиды, аминокислоты и
ДР-
Как основания можно титровать: амины, азотсодержащие
гетероциклические соединения, амиды, четвертичные
аммониевые основания и др.
Оптимальные условия титрования для слабых кислот
достигаются в основных неводных растворителях, таких
как пиридин, диметилформамид; для слабых оснований
- в кислых неводных растворителях, таких как
уксусная кислота и уксусный ангидрид.
Соли некоторых органических и минеральных кислот
могут быть оттитрованы как основания в кислых растворителях.
В случае титрования солей галогенводородных кислот
перед титрованием прибавляют обычно раствор
ртути(Н) ацетата для связывания ионов галогенов в
малодиссоциирующие соединения. При использовании
уксусного ангидрида в качестве растворителя
возможно титрование солей галогенводородных кислот,
преимущественно хлоридов, без прибавления
ртути(Н) ацетата.
Для раздельного титрования смесей кислот или смесей
оснований используют дифференциирующие растворители,
т.е. растворители с величиной рК., обычно
превышающей 15, не обладающие выраженными
кислотно-основными свойствами, такие как кетоны,
нитрилы, нитрометан.
В ряде случаев для титрования применяют смеси неводных
растворителей, один из которых является ап-
ротонным (бензол, хлороформ и др.). Присутствие
апротонного растворителя уменьшает ионное произведение
среды (К.), что может способствовать улучшению
условий титрования.
Метод неводного титрования применяют также для
количественного определения веществ, содержащих
карбонильную группу, обладающих слабо выраженными
кислотно-основными свойствами и не поддающихся
прямому титрованию в неводных растворителях.
В этом случае проводят реакцию оксимирования
в неводных растворителях и осуществляют количественное
определение карбонилсодержащих веществ путем
титрования избытка реагента. Метод применяют
для количественного определения различных классов
органических соединений, альдегидов, кетонов, хро-
монов, стероидных гормонов, гликозидов и др.
Титрование в неводных средах может быть проведено
как с индикаторами, так и Потенциометрически с использованием
в качестве индикаторного стеклянного
или других, обратимых к протону электродов. В качестве
электрода сравнения обычно используют . . . . -
серебряный электрод.
При проведении потенциометрического титрования в
неводных средах электролитический мост или электрод
сравнения запопняют растворами калия хлорида
или лития хлорида в соответствующих неводных растворителях
При титровании в основных растворителях следует
принимать меры для защиты титруемого раствора и
титранта от углерода диоксида, содержащегося в воздухе.
Титрование лучше проводить в атмосфере инертного
газа (азота, гелия).
В Табл. 1 приведены наиболее часто применяемые
неводные растворители, индикаторы и титранты.
Таблица 1
Растворители, индикаторы и титранты, наиболее часто применяемые в неводном титровании
Растворители Индикаторы Титранты
Кислые
Уксусная и муравьиная
кислоты, уксусный ангидрид
и их смеси с другими
растворителями
Кристаллический фиолетовый,судан
III, тропеолин 00, метиловый фиолетовый,
нейтральный красный, малахитовый
зеленый, диметиламиноазо-
бензол
Раствор хлорной кислоты в уксусной
кислоте или нитрометане
Основные
Диметилформам.ид, пиридин,
этилендиамин
Тимоловый синий, бромтимоловый
синий, а-нафтолбензеин, о-нитро-
анилин
Растворы натрия гидроксида, калия гид-
роксида, натрия метилата, лития мети-
лата, тетраэтиламмония гидроксида в
метаноле или в смеси длетанола и бензола
Дифференцирующие
Ацетон, диоксан, нитроме-
тан, метилэтилкетон, метанол,
изопропанол, третбу-
танол, диметилсульфоксид
Метиловый оранжевый, тимоловый
синий, нейтральный красный, метиловый
красный, бромтимоловый синий
Растворы кислоты хлороводородной в
метаноле или в гликолевых смесях; растворы
кислоты хлорной в нитрометане,
в метаноле или в гликолевых смесях;
растворы, применяемые при титровании
в основных растворителях
Таблица 2
Величины рК различных растворителей fpK = -IgKJ при температуре от 20 °С до 25 0C
Растворитель PK1 1 Кислота серная 3.62
2
3
4
5
Кислота муравьиная 6.10 Кислота уксусная 14.4
Уксусный ангидрид 14.5
Этилендиамин , 15.3
6 Этиленгликоль 15.6
7
8
Формамид 16.7 Метанол 16.7
Пропилен гликоль 16.8
10 Диэтиленгликоль 17.5
11 Этанол 19.1
12 Кислота масляная 19.2
13 н-Бутанол 20.1
14 Метилцеллозольв 20.7
15 Изопропанол 22.0
16 Диметилацетамид 23.9
17 Нитрометан 24.0
18 .-Метилпирролидон 24.2
19 Пиридин 24.2 j
20 Диметилсульфоксид 97 % <. 24.5
21 Димети л формамид 25.3
22 Метилбутилкетон 25.3 ~~
23 Сульфолан 25.5
24 Метилэтилкетон 25.7
25 Ацетон 25.9
26 Ацетон 90 % "' 20.3
27 трет- Бутанол 26.8 ~
28 Пропиленкарбонат 29.2
29 Амдииак жидкий 29.8
30 Ацетонитрил 32.2 ~
31 Диметилсульфоксид 33.3
второй компонент - вода
Величины РКА кислот в различных растворителях (рКд= - IgKn)
Кислота
Растворитель
ш
с[
О
со
1
Метанол
Спирт 95%
Бутанол
Изопропанол
трет - Бутанол
Этиленгликоль
Пропиленгликоль
Метилцеллозольв
Ацетон
Ацетон 90%
Метилизобутилкетон
i Метилэтилкетон
I . _ .
I
Формамид
Хлорная 3.94 2.90 2.20
Серная 1.44 3.42 5.48
Азотная 0.2 3.17 3.75 4.66
Хлороводородная 0.8 1.05 1.95 3.10 5.50 8.90 2.47 8.30
Бромоводороднэя 02 2.0 5.0
п-Толуолсульфоновая 3.82
Уксусная 4.75 9.70 10.41 10.35 11.35 14.27 8.32 9.10 11.10 12.55 10.27 16.6 6.91
Монохлоруксуснач 2.86 7.80 8.51 8.50 9.23 12.24 6.05 9.10 11.20 7.60 15.4 4.50
Дихлоруксусная 1.31 6.30 7.14 7.30 7.80 10.27 4.50 10.20 10.26
Трихлоруксусная 0.70 4.90 5.70 6.30 5.90 8.20 8.86 1.46
Фенил уксусная 4.31 8.06 8.78 6.57
Муравьиная 375 9.15 8.82 9.70 16.70 5.74
Бензойная 4.20 9.52 10.13 10.24 15.10 8.16 8.83 10.70 11.95 9.70 16.6 6.36
п-Нитробензойная 3.40 8.40 8.87 9.10 9.60 12.04 10.59 8.09 5.88
м-Нитробензойная 3.46 8.30 9.0 9.15 9.20 10.66 8.03 5.40
п-Аминобензойная 4.92
3,5-динитро бензойная 2.80 8.31 10.60 9.63 18.80 9.78 I
Салициловая 2.89 7.90 8.60 7.73 9.53 8.90 9.53 7.22 13.0 4.73 !
Ацетилсалициловая 3.50 16.30
Никотиновая 4.73 16.60 15.0
барбитуровая 4.01
Винная 3.03 7.40
Лимонная 3.10 10.1
Фенол 9.89 14.2 19.08 22.3
Резорцин 9.20
о-Нитрофенол 7.17 13.82 10.75
п-Нитрофенол 17.15 11.0 11.0 11.19 14.48 13.52 10.93 8.53 J м-Нитрофенол 8.30 12.6
2,4-Динитрофенол 4.02 7.85 8.21 8.36 10.68 8.76 6.45 9.31 4.52
2,5-Динитрофенол 5.22 8.98 8.10 5.94
2,6-Динитрофенол 3.71 7.63 6.77 17.60 4.17 .
3,5-Динитрофенол 6.70 10.83 13.40
Пикриновая 0.80 4.80 3.93 4.50 3.70 3.65 3.17 2.18 11.0 3.70 1.33
Барбитал 7.43 12.69 16.8 19.0
Фенобарбитал 7.21 19.20 13.30
Сульфадимезин 7.51 19.60 18.70
Сульфадиметоксин 5.90
Сульфамеразин 7.10
Норсульфазол 6.80
Сульгин 13.00 — Метилурацил 9.70 I
Фторурацил 7.98 I
Тиоурацил 7.82
Цинхофен 622
Рутин 8.96 10.34 13.15
Кверцетин 8.21 9.18 14.41
Ликуразид 9.49 12.30 14 34
Изосалипурпозид 7.67 11.66 12.90
Неодикумарин 437 5.71 7.37
Зоокумарин 4.70 9.63 7.81
Таблица 3
Раство эитель
Диметилформамид
ч
S
.
ас
О
•.-
с
.
с
.- .) .
S
CI
Ct
о
о
-.- л с >. о с; S ь O)
S
S
Ct
Ct
S
S
!2
O)
3·
СО
с;
S .- .) S
S
CI
TO
X о ю
Cu
i i
Q) г— с; .>
S
CT о Q-
с
S
CL
I -
S I
о
. .)
=г
<
X
го
. .)
S о о.
ь
S
X
X
о
Ct
S с
о
CL
Cl
S с с;
S
O)
2
Z
X
CI
S
Cl
S CZ
>s
S
ье
Ct
S
го
S
S
S
<
га
X о >. .
>>
СО .- . с . S ZZl
со
X
S л
m CO
CL >ч
S
со .- . с о
о; со
X к с; о со
2
со .- . с; .
Ct
S
а.
Ct
S
UX
со
>s
л
X
о
г?
5.34 1.90 2.23 3.23 2.27 2.70 0.28 12.1 0.90
3.10 4.60 5.10 4.25 0.58 4.90
8.80 4.30 2.37 5.10 14.2 8.20
7.77 6.20 8.10 4.08 5.40 2.89 5.30 0.89 13.3 8.30
1.80 5.51 4.36 4.90
1.55 5.30 2.68 0.34 12.90
13.50 12.60 12.60 18.81 22.30 20.50 13.30 11.44 4.11
10.10 8.90 8.75 16.55 L 18.80 17.0 10.90
15.80 14.10 8.30
10.60 11.30
12.90 11.60 20.10
11.55 17.09 12.0 8.84
12.20 11.10 11.0 19.67 20.70 19.60 12.30 9.80
10.60 9.0 18.70 17.60 10.50 7.94
10.82 9.20 19.29 17.60 10.70 8.16
10.20
8.95 7,40 16.90
8.30 6.80 8.34 6.90 15.23 16.70
11.30
10.80 9.60 9.60
12.32 6.67
8.90
10.60
18.0 16.40 15.62 26.60 25.70 17.60 16.20
14.73
12.14 11.0 22.0 21.40 12.60 10.03
11.83 11.0 19.71 20.80 20.10 12.50 9.60
21.24 22 23 24 25 26 27 28
6.36 5.20 14.87 16.0 15.90 6.80 4.38
8.78 16.45 17.50 17.9 5.76
6.18 4.90 16.8 16.0
11.42 10.60 20.50 19.40
3.65 1.0 9.90 11.0 10.50 3.65
13.0 11.15 23.4
13.40 10.98 10.9
13.0 11.0
7.47
— 7.43
11.22
18. 05
15.30 13.0
12.40 10.1
12.20 10.8
11.12
11.22
13,15
11 83
5.75
8.45
12.1
11.63
13.28
12.20
G.23
990
11.28
—
Величины рКл оснований в различных растворителях (РКА=РКГРКВ=РКТ)
Основание Растворитель
<ч Ч о со
Метаол
Этанол 95 %
Этиленгпи-коль
Пропиленгли-
Метипцелло-
зольв
.-метилпирро
лидон
Кислота
муравьиная
Кислота уксусная
Уксусный
ангидрид
Тетраметилгуэнидин 13.60
Гуанозин 12.40 15.0
Пиперидин 11.20 11.0 12.51 12.52 11.71 10.40 10.1
Диэтиламин 10.90 12.20 9.20 5.19 10.10
Бензиламин 9.62 11.30
Цитидин 9.80 13.20
Аденин 9.90 13.70
Трибутиламин 9.85 10.10
Триэтипамин 10.70 11.15 10.87 8.70 10.20 11.50
Диметипамин 10.60 10.0
.-... иламин 10.60
Аденозин 10.55 14.90
Дифенилгуанидин 10.10 13.60 15.26 8.90 10.0
Аммиак 9.30 11.70 10.10
Анилин 4.58 6.10 5.70 6.12 6,12 5.49 8.60
Диметиланилин 5.10 4.50 4.40 9.93
Диэтиланилин 6.52 10.20 10.60
п-Хлоранилин 4 00 4.66 9.27
м-Хлоранилин 3.52 4.35 9.25
о-Китроанилин 0.29 6.95
м-Нитроанипин 2.50 4.25 6.70
п-Нитроанипин 1.02 1.29 1.01
Пиридин 5.15 5.54 4.30 5.92 5.69 5.50 10.0 9.90
п-Толуидин 5.07 6.60 6.30
м-7олуидин 4.71 3.20 5.90
а-Пиколин 5.95 6.24 5.54 6.38 6.09
а-Нафтиламин 3.92 5.66 5.10 5.05 9.60
Дифениламин 0.90 3.18 7.45
Ацетамид 0.48 6.75 8.60
Ацетоксим 1.81 8.42
Тиомочевина 0.96 7.75
Эфедрин 9.70 11.29 8.90
Атропин 9.60 11.30
Цитозин 9.40 12.50
Новокаин 8.80 11.30
Промедол 8.40 11.30
Морфолин 8.70 10.14 9.19
Тебаин 8.30
Димедрол 8.20
Платифиллин 8.10 11.50
Кодеин 8.00 3.60 11.40 9.38 5.11 10.80
Морфин 7.80 8.60 9.51 5.08
Гидразин 8.11 11.10
Хинин 8.00 5.23 11.50
Бруцин 7.96
Этилморфин 7.90 11.10
Спазмолитин 7.70 11.60
Пилокарпин 6.80 10.90
Резерпин 6.60 9.54
Наркотин 6.20 7.20
Гидроксиламин 5.97 9.00
Папаверин 5.90 6.92 7.25 10.80
Тифен 6.30 11.30
Уротропин (гексаметилентетрамин) 4.90 9.70 7.00
Хинолин 4.80 4.58 5.39 5.27 9.86
Амидопирин 4.80 9.13
Дибазол 4.20 9.00
Акридин 4.11
Теофиллин 2.60 6.60
Фенацетин 2.20 6.00
Антипирин 1.51 8.35 9.60
Кофеин 0.60 5.17 6.30
Теобромин 0.10 5.26 6.10
Мочевина 0.20 4.67 7.65 9.36
Ацетанилид 0.40 6.80 7.30
Таблица 4
Растворитель
Ацетон
X
g
.
С
X R с X
f -
0>
S
Метилизобу-
тилкетон
Формамид
Диметилформамид
Диметил-
сульфоксид
Пропилен-
карбонат
Нитрометан
Ацетонитрил
20.30 13.65 13.20 23.3
12.24 13.48 11.08 10.40 18.53 18.22 18.92
13.44 10.10 10,50 18.69 17.95 18.70
17.77 18.10
11.62 12.40 9.99 9.25 9.0 17.91 18.35 18.46
10.40 17.96 18.73
10.50 11.10 16.86 18.26
15.90 8 9 0 17.00 17.20 17.90
9,45 10.50 15.90 15.70 16.46
5 92 9.63 4.10 4.36 3.60 10.56 9.07 10.56
4.91 6.20 2.51 11.15 11.04
6.26 7.20 12.08
5.34 3.26 7.99
4.85 8.40 2.75 7.74
3 9 7 7.40 6.62
3.52 5.18
5.77 6.94 4.43 3.30 3.40 11.92 12.16 19.33
6.57 6.81 5.81 10.90 9.80 11.25
6.15 9.70
6.64
5.42 6.38 9.71
3.87 5.24
9.50
8.60
14.40 8.20
16.61 15.18 16.61 15.80
11.01
7.70
9.62 11.18 8.30
9.57 8.30
8.75
12.90
13.60 7.00
8.10 8.30
8.03 6.60
13.40
9.80
5.41 11.40
9.30 6.20
6.40
3.20
6.04
ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ
МЕТОДИК И ИСПЫТАНИЙ 1
В статье описываются процедуры, применяемые для
валидации методик л испытаний121, включаемых в монографии
Государственной Фармакопеи Республики
Казахстан и аналитическую нормативную документацию
на лекарственные средства и вспомогательные
вещества (частные статьи). Поскольку в частные статьи
включаются различные инструментальные и неинструментальные
испытания (определение подлинности,
контроль примесей, количественное определение
и др.), требования к валидации испытания зависят от
его типа и применяемого аналитического метода.
А. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
ПРИ ВАЛИДАЦИИ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК
1. Введение
Валидация аналитической методики — это экспериментальное
доказательство того, что методика пригодна
для решения предполагаемых задач.
В данном, разделе рассматриваются характеристики
аналитических методик (испытаний), подлежащие валидации
(далее «валидационные характеристики»).
Валидационные характеристики методик, применяемые
для целей идентификации, контроля примесей и количественного
определения, приведены в Табл. 5.
2. Аналитические испытания и методики, подлежащие
валидации
В статье рассматривается проведение валидации для
таких испытаний:
- испытаний на идентификацию;
- количественных испытаний для определения примесей;
- испытания но предельное содержание131 примесей;
- количественных испытаний для определения действующего
вещества и других компонентов (например,
консервантов) в лекарственных субстанциях и готовых
лекарственных средствах.
Все аналитические методики и испытания, входящие в
монографии и аналитическую нормативную документацию,
должны быть валидированы. Однако для валидации
некоторых испытаний, например, таких как «Растворение
» или «Определение размера частиц», могут
потребоваться другие валидационные процедуры,
не описанные в общей статье.
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИСПЫТАНИЙ
Испытания на идентификацию предназначены для
подтверждения наличия анализируемого вещества в
образце. Обычно это достигается путем сравнения
каких-либо свойств (например, спектральных характеристик,
хроматографического поведения, химической
реакционной способности и т.д.) испытуем.ого и
стандартного образцов.
Испытания, предназначенные для контроля примесей
могут быть как количественными, так и предельными.
Назначение обоих испытаний - характеризовать чистоту
образца. Для валидации количественных и предельных
испытаний необходимы различные валидационные
характеристики.
Количественное определение предназначено для определения
анализируемого вещества в образце. Такая
же валидационная процедура может быть применена
к методике количественного определения, связанной
с другим испытанием (например, в испытании
«Растворение»).
3. Валидационные характеристики и требования
Набор исследуемых валидационных характеристик
зависит от назначения аналитической методики. Типичные
валидационные характеристики:
- правильность;
- точность;
- сходимость;
- внутрилабораторная точность;
- специфичность;
- предел обнаружения; « ж * - *»
- предел количественного определения;
- линейность;
- диапазон применения.
Этот список следует рассматривать как типовой для
указанных испытаний (аналитических методик). Как
правило, на стадии разработки методики изучается
также валидационная характеристика робастность.
п | Гармонизовано с «Руководством по разработке монографий» Европейской Фармакопеи.
и Испытание - это аналитическая методика, описанная в частной статье, в совокупности с требованиями к получаемым по ней результатом.
Результатом проведения испытания является ответ но вопрос, соответствует или нет данное лекарственное средство требованиям
частной статьи.
Испытания на предельное содержание примесей
некоторого установленного уровня
это такие испытания, которые регламентируют содержание примесей не выше
Таблица 5
Валмдационные характеристики, рассматриваемые для разли чных испытаний и методик
Типы аналитических методик
Характеристики Идентификация
Испытания
на примеси
Количественное
определение
Количественные
Предельные
Растворение, определение
только содержания,
активности
Правильность - + - +
Точность:
Сходимость + - +
Внутрилабораторная
точность
-
Специфичность ** + + + +
Предел обнаружения - *** +
Предел количественного
определения
- + - -
Линейность - + - +
Диапазон применения - + +
«+»
характеристика обычно не исследуется;
характеристика обычно исследуется;
в тех случаях, когда проводится исследование воспроизводимости, исследование внутрилабораторной точности
не требуется;
недостаток специфичности испытания можно компенсировать другим (другими) дополнительным испытанием
(см. п. 4.2);
может потребоваться в некоторых случаях (например, когда предел определения и нормируемый предел
содержания определяемой примеси близки).
Повторное проведение валидации может потребоваться
в следующих случаях:
- изменение в синтезе лекарственной субстанции;
- изменение в составе готового лекарственного средства;
- изменения в аналитической методике.
Объем проведения повторной валидации определяется
спецификой изменений. Повторная валидация
может требоваться и в иных случаях.
4. Словарь
4.I. Аналитическая методика (analytical procedure) -
это способ проведения анализа, т.е. детальное изложение
всех операций, необходимых для выполнения
испытания. Она включает в себя описание подготовки
испытуемых образцов, стандартов, реактивов; описание
используемого оборудования с указанием параметров;
условия получения калибровочных кривых,
использование расчетных формул и т.д.
4.2. Специфичность (specificity) - способность однозначно
оценивать анализируемое вещество в присутствии
других компонентов, которые могут присутствовать
в образце. Это могут быть примеси, продукты
разложения, вспомогательные вещества и т.д.
Недостаток специфичности испытания может быть
компенсирован другим (другими) дополнительным испытанием.
Специфичность для различных типов испытаний означает
следующее:
Идентификация - доказательство того, что идентифицировано
именно анализируемое вещество.
Испытания на примеси - доказательство того, что
каждое испытание на примеси позволяет однозначно
характеризовать содержание примесей в образце
(например, испытания «Сопутствующие примеси», «Тяжелые
металлы», «Содержание остаточных количеств
органических растворителей» и др.).
Количественное определение (содержание или
активность) - доказательство того, что методика позволяет
точно и правильно установить содержание
или активность именно анализируемого вещества в
образце.
4.3. Правильность (accuracy, trueness) характеризует
степень соответствия между известным истинным значением
или справочной величиной и значением, полученным
по данной методике.
4.4. Точность (precision) аналитической методики выражает
степень близости (или степень разброса) результатов
для серии измерений, выполненных по данной
методике на различных пробах одного и того же
однородного образца. Точность может рассматриваться
на трех уровнях: сходимость, внутрилаборсторная
точность и воспроизводимость.
Точность необходимо изучать на достоверно однородных
образцах. Однако, если однородный образец
получить невозможно, то можно использовать его
раствор или модельные смеси.
Точность аналитической методики обычно характеризуют
отклонением, стандартным отклонением или относительным
стандартным отклонением для серии измерений.
4.4.1. Сходимость (repeatability)характеризует точность
методики при ее выполнении в одних и тех же условиях
(в частности, одним и тем же аналитиком или группой
аналитиков) в течение небольшого промежутка
времени.
4.4.2. Внутрилабораторная точность (intermediate
precision)характеризует влияние внутрилабораторных
вариаций: различные дни, различные аналитики, различное
оборудование и т.п. изменения.
4.4.3. Воспроизводимость (reproducibility) характеризует
точность в м,ежлабораторном эксперименте.
4.5. Предел обнаружения для конкретной аналитической
методики представляет собой минимальное
количество анализируемого вещества в образце, которое
может быть обнаружено (при этом, не обязательно
должно быть определено точное значение).
4.6. Предел количественного определения для аналитической
методики представляет собой минимальное
количество анализируемого вещества в образце, которое
может быть количественно определено с требуемой
правильностью и точностью. Предел количественного
определения является валидационной характеристикой
методик количественного определения
малых концентраций веществ в образце и рассматривается
в основном при определении примесей и/или
продуктов разложения.
4.7. Линейность (linearity) - это способность длетодики
(в пределах диапазона применения) давать величины,
прямо пропорциональные концентрации (количеству)
анализируемого вещества в образце.
4.8. Диапазоном применения (range) аналитической
методики является интервал между минимальной и
максимальной концентрациями (количествами) анализируемого
вещества в образце (включая эти концентрации),
для которого показано, что аналитическая
методика имеет требуемую точность, правильность и
линейность.
4.9. Робастность (robustness) - это способность аналитической
методики не подвергаться влиянию малых,
задаваемых (контролируемых) аналитиком изменений
в условиях выполнения методики. Робастность является
показателем надежности методики при ее использовании
в указанных условиях.
В. ПРОВЕДЕНИЕ ВАЛИДАЦИИ АНАЛИТИЧЕСКИХ
МЕТОДИК
Т. Введение
Главной задачей валидации аналитической методики
является экспериментальное доказательство того, что
данная методика пригодна для достижения тех целей,
для которых она предназначена. В отчет по валидации
должны быть включены все данные, полученные в
процессе валидации, и использованные для расчетов
формулы с соответствующим их обсуждением.
Подходы к проведению валидации методик анализа
биологических и биотехнологических препаратов могут
быть иными, чем указано в данной статье.
При проведении валидации необходимо использовать
только стандартные образцы с известными характеристиками,
подтвержденными документально. Необходимая
степень их чистоты зависит от задач, которые
решаются при их использовании.
Последовательность рассмотрения валидационных
характеристик отражает процесс, по которому может
разрабатываться и валидироваться аналитическая
методика. Однако целесообразно планировать
эксперимент так, чтобы соответствующие валидационные
характеристики изучались одновременно, например:
специфичность, линейность, диапазон применения,
правильность и точность.
2. Специфичность
Исследование специфичности проводится при валидации
испытаний на идентификацию, контроль примесей
и количественное определение. Способ подтверждения
специфичности зависит от задач, для решения
которых предназначена аналитическая методика.
В тех случаях, когда методика недостаточно специ-
фична, применяют сочетание двух или более аналитических
методик для достижения необходимого уровня
избирательности.
2 . 1 . Идентификация. Испытания на идентификацию
должны обеспечивать возможность различать
соединения близкого строения, которые могут присутствовать
в образце совместно с определяемым
компонентом. Избирательность методики может быть
подтверждена получением положительных результатов
(возможно, путем сравнения с известным стандартным
образцом) для образцов, содержащих определяемый
компонент, и отрицательных результатов,
полученных для образцов, не содержащих его. Для
подтверждения отсутствия ложноположительных результатов
испытание на идентификацию может быть проверено
для веществ с близким строением или сопутствующих
анализируемому веществу. Выбор потенциально
мешающих проведению испытания веществ
должен быть обоснован.
2.2. Количественное определение и испытания
на примеси. При валидации хроматографических
методик для подтверждения специфичности должны
использоваться характерные хроматограммы с указанием
индивидуальных веществ. Аналогичный подход
используют и для других методов разделения.
Для хроматографических методик степень разделения
должна быть исследована для соответствующих концентраций
веществ. Для подтверждения специфичности
может быть использована степень разделения двух
наиболее близко элюирующихся веществ.
В случае использования неспецифичного метода количественного
определения необходимо применять
дополнительные аналитические методики и подтверждать
специфичность всего комплекса методик. Например,
если количественное определение проводится
титриметрическим методом, то его можно дополнить
соответствующим испытанием на примеси.
Для количественного определения и для испытаний на
примеси применяют одинаковые подходы, описанные
ниже.
2.2.1. Образцы примесей имеются. Для метода количественного
определения необходимо подтвердить
избирательность определения анализируемого вещества
в присутствии примесей и/или других компонентов
образца. Это можно сделать внесением в образец
(субстанцию или лекарственное средство) примесей
и/или других компонентов образца в соответствующей
концентрации и последующего доказательства
того, что это не отразилось на получаемом результате
(путем сравнения результатов, полученных на исходном
и загрязненном образцах).
Для испытаний на чистоту подтверждение избирательности
проводят путем загрязнения субстанции или
готового лекарственного средства соответствующими
количествами примесей и доказательства разделения
этих примесей как друг от друга, так и от других
компонентов образца.
2.2.2. Образцы примесей отсутствуют. В случае, если
образцы примесей или продуктов разложения отсутствуют,
подтверждение специфичности проводят путем
сравнения результатов анализа образцов, содержащих
примеси или продукты разложения, предлагаемой
методикой и другой арбитражной методикой. В
качестве последней может быть использована фармакопейная
методика или другая валидированная
методика. Этот подход предполагает предварительное
загрязнение образца продуктами разложения
путем выдерживания его в стрессовых условиях: воздействие
света, тепла, влажности, гидролиза, окисления
и т.п.
При валидации количественного определения следует
сравнить результаты анализов, полученные с использованием
валидируемой и арбитражной методик.
При валидации испытания на чистоту следует сравнить
результаты определения примесей, полученные
с использованием валидируемой и арбитражной методик.
Для доказательства того, что пик анализируемого вещества
соответствует только одному компоненту, используют
тесты на чистоту пиков, например, с использованием
диодно-матричного детектирования, масс-
спектрометрии и др.
3. Линейность
Линейная зависимость должна быть исследована в
пределах диапазона применения аналитической методики.
Она может быть подтверждена непосредственно
на субстанции (путем разбавления исходного раствора)
или, для лекарственных средств, на модельных
смесях с использованием соответствующей процедуры.
По полученным данным строят график зависимости
сигнала как функции концентрации или количества
определяемого компонента и визуально оценивают
его линейность. Если линейная зависимость наблюдается,
то результаты обрабатывают подходящим статистическим
методом, например, методом наименьших
квадратов. В некоторых случаях для получения
линейности данные следует подвергнуть предварительному
математическому преобразованию. Должны быть
определены и представлены: коэффициент корреляции,
точка пересечения с осью ординат, тангенс угла
наклона прямой и остаточная сумма квадратов отклонений,
а также график со всеми экспериментальными
данными. Для оценки линейности могут понадобиться
отклонения экспериментальных данных от прямой.
Некоторые аналитические методики, например, им-
муноаналитические, не показывают линейности ни при
каких математических преобразованиях. В таких случаях
аналитический отклик должен быть описан подходящей
функцией концентрации анализируемого вещества
в образце.
Для подтверждения линейности используют не менее
пяти концентраций. Другие подходы должны быть обоснованы.
4. Диапазон применения
Диапазон применения методики зависит от ее пред*
назначения и определяется при изучении линейности
В пределах диапазона применения методика должна
обеспечивать требуемую линейность, правильность и
точность.
Минимальные допустимые диапазоны применения
методик:
- Для количественного определения лекарственных
субстанций или лекарственных форм - от 80 %
до 120 % от номинального содержания.
- Для однородности дозирования - от 70 % до
130 % от номинального содержания, если для испытания
не требуется более широкий интервал (например,
для дозированных аэрозолей).
- Для испытаний на растворение - ± 20 % (абсолютных)
от нормируемой величины высвобождения.
Например, если при контроле высвобождения пролонгированных
лекарственных средств нормируемая
величина высвобождения составляет от 20 % за первый
час и до 90 % за 24 ч, то диапазон применения
должен быть от 0 % до 110 % от номинального содержания.
- Для определения примесей - от концентрации,
в которой примесь обычно обнаруживается, до 120 %
от нормируемого содержания.
Для примесей, обладающих чрезвычайно сильным
действием или имеющих токсический или непредсказуемый
фармакологический эффект, предел детектирования/
количественного определения должен соответствовать
тому уровню концентрации, на котором
эти примеси должны контролироваться.
Примечание: при проведении валидации испытания
на примеси непосредственно в процессе разработки
методики необходимо определить диапазон применения,
внутри которого находится предполагаемый предел
нормирования примесей.
В случае, если количественное определение и испытание
на примеси выполняются совместно, как одно
испытание и используется только стандарт основного
вещества, соответствующий его номинальному содержанию,
то диапазон применения должен охватывать
диапазон концентрации от нормируемого содержания
примеси до 120 % от номинального содержания
основного вещества.
5. Правильность
Правильность изучают в пределах диапазона применения
аналитической методики.
5 . 1 . Количественное определение
5.1.1, Субстанции. Могут использоваться следующие
способы определения правильности:
- применение аналитической методики к образцу
с известной степенью чистоты, например, к стандартному
образцу;
- сравнение результатов анализа, полученных с
использованием валидируемой методики и арбитражного
метода, правильность и точность которого известны
(использование независимого метода, см. п. 2.2.);
- заключение о правильности можно сделать
лосле того, как установлены точность, линейность и
специфичность.
5.1.2. Готовые лекарственные средства. Могут использоваться
следующие способы определения правильности:
- применение методики к искусственным смесям,
к которым были добавлены известные количества анализируемого
вещества;
- в случае, когда невозможно получить образцы
всех компонентов лекарственного средства, возможно
применение метода добавок или арбитражной
методики, правильность которой доказана (см. п. 2.2.);
- заключение о правильности можно сделать
после того, как установлены точность, линейность и
специфичность.
5.2. Примеси (количественное содержание).
Правильность изучают на образцах (субстанции или
готового лекарственного средства) с добавленным
известным количеством примесей.
Если примеси или продукты разложения недоступны,
применяют арбитражный метод (см. п. 2.2.). Если примеси
неизвестны, то чувствительность их определения
может быть принята равной чувствительности определения
субстанции. В случае, если чувствительность
определения субстанции и примеси существенно отличается,
вводят коэффициент пересчета.
Должен быть указан конкретный способ нормирования
содержания примесей, например, в массовых процентах,
в процентах по отношению к площади пика
главного компонента или др.
5.3. Представление данных. Правильность оценивают
не менее чем для девяти определений для трех
различных концентраций, охватывающих весь диапазон
применения, т.е. три концентрации и три опреде-
ления для каждой концентрации. Определения должны
включать все стадии методики.
Правильность выражают в процентах найденного значения
от введенного или как разность между средним
и истинным значением с учетом соответствующих доверительных
интервалов.
6. Точность
Валидационная характеристика «точность» изучается
для методик количественного определения.
6 . 1 . Сходимость. Сходимость изучают, выполняя:
- не менее девяти определений, охватывающих
диапазон применения методики (три концентрации/
три повтора) или
- не менее шести определений для образцов с
содержанием анализируемого вещества, близким к
номинальному.
6.2. Внутрилабораторная точность. Устанавливают
влияние случайных факторов на точность валидируемой
аналитической методики. Типичными исследуемыми
факторами являются различные дни, различные
аналитики, различное оборудование и т.п. При
изучении влияния различных факторов предпочтительно
использовать планирование эксперимента.
6.3. Воспроизводимость. Воспроизводимость оценивают
путем проведения межлабораторных исследований.
Воспроизводимость должна быть изучена при
включении методики в Фармакопею.
6.4. Представление данных. При изучении точности
должны представляться: стандартное отклонение,
относительное стандартное отклонение и доверительный
интервал.
7. Предел обнаружения
В зависимости от того, является ли методика инструментальной
или неинструментальной, возможны различные
подходы для определения предела обнаружения.
Используются следующие подходы.
7 . 1 . Визуальная оценка. Визуальную оценку
используют как для неинструментальных, так и для
инструментальных методов.
Предел обнаружения устанавливают путем анализа
образцов с известными концентрациями анализируемого
вещества и оценкой минимального содержания,
при котором анализируемое вещество надежно определяется.
7.2. Соотношение Сигнал/Шум. Этот подход
применим только к тем методам», для которых наблюдается
шум базовой линии. Для определения соотношения
сигнал/шум сравнивают величины сигналов,
полученные для контрольного опыта и для образцов с
низкими концентрациями анализируемого вещества.
На основании полученных данных устанавливают минимальную
концентрацию, для которой величина отношения
сигнал/шум составляет обычно от трех до
двух.
7.3. Использование калибровочной прямой и
стандартного отклонения аналитического сигнала.
Предел обнаружения (ПО) может быть выра
жен как:
ПО = З.З-. / S , (1)
где
. - стандартное отклонение сигнала;
S — тангенс угла наклона калибровочной
прямой.
Значение тангенса угла наклона калибровочной прямой
вычисляют из калибровочной прямой для анализируемого
вещества. Оценка стандартного отклонения
сигнала может быть проведена многими способами,
например следующими.
7.3.1. Использование стандартного отклонения сигнала
для контрольного опыта.
Измеряют величину аналитического сигнала для необходимого
числа образцов, не содержащих анализируемое
вещество, и вычисляют стандартное отклонение.
7.3.2. Использование калибровочной прямой.
Получают калибровочную прямую для образцов с
содержанием анализируемого вещества, близким к
пределу обнаружения, и вычисляют ее параметры. В
качестве стандартного отклонения S в формуле (1)
может быть использовано стандартное отклонение
свободного члена линейной зависимости.
7.4. Представление данных. Представляют значение
предела обнаружения с указанием способа,
использованного для его определения. Если определение
предела обнаружения основывается на отношении
сигнал/шум, представляют соответствующие
хроматограммы.
Если значение предела обнаружения получено путем
вычислений или экстраполяции, его оценка должна быть
подтверждена анализом необходимого числа образцов
с содержанием анализируемого вещества, близким
к пределу обнаружения.
8. Предел количественного определения
Возможны несколько подходов для определения предела
количественного определения, зависящих оттого,
является ли методика инструментальной или неинструментальной.
Могут быть использованы следующие
подходы.
8 . 1 . Визуальная оценка. Визуальную оценку
используют как для неинструментальных, так и для
инструментальных методов.
Предел количественного определения устанавливают
путем анализа образцов с известными концентрациями
анализируемого вещества и оценкой минимального
содержания, при котором анализируемое вещество
определяется количественно с требуемой правильностью
и точностью.
8.2. Соотношение Сигнал/Шум. Этот подход
применим только к тем методам, для которых наблюдается
шум базовой линии (см. 7.2.). Для определения
соотношения сигнал/шум сравнивают величины сигналов,
полученные для холостого опыта и для образцов
с низкими концентрациями анализируемого вещества.
На основании полученных данных устанавливают
минимальную концентрацию, для которой величина
отношения сигнал/шум составляет около 10:1.
8.3. Использование калибровочной прямой и
стандартного отклонения сигнала
H O = I O G Z S , (2)
где
. - стандартное отклонение сигнала;
S — тангенс угла наклона калибровочной
прямой.
Значение тангенса угла наклона калибровочной прямой
может быть определено из калибровочной прямой
для анализируемого вещества. Оценка стандартного
отклонения сигнала может быть проведена многими
способами, например, следующими.
8.3.1. Использование стандартного отклонения сигнала
для контрольного опыта. Измеряют величину
аналитического сигнала для необходимого числа образцов,
не содержащих анализируемое вещество, и
вычисляют стандартное отклонение.
8.3.2. Использования калибровочной прямой. Получают
калибровочную прямую для образцов с содержанием
анализируемого вещества, близким к пределу
обнаружения, и вычисляют ее параметры. В качестве
стандартного отклонения . в формуле (2) может
быть использовано стандартное отклонение свободного
члена линейной зависимости.
8.4. Представление данных
Представляют значение предела обнаружения с указанием
способа, использованного для его определения.
Значение предела определения должно быть подтверждено
анализом необходимого числа образцов
•'-ржанием анализируемого вещества, близким, к
., о б н а р у ж е н и я.
9. Робастность
Оценку робастности проводят на стадии разработки
методики с учетом типа изучаемой методики. Эта оценка
должна доказать надежность результатов анализа
при небольших изменениях параметров методики.
Если на результаты анализа влияют условия его проведения,
то эти условия должны быть стандартизированы,
и в текст методики вносят соответствующие предостережения.
Типичные примеры изучаемых параметров:
- устойчивость во времени аналитических растворов;
- время экстракции.
В случае жидкостной хроматографии:
- рН подвижной фазы;
- состав подвижной фазы;
- колонки (различные серии и/или поставщики);
- температура;
- скорость подвижной фазы.
В случае газовой хроматографии:
колонки (различные серии и/или поставщики);
- температура;
- скорость газа-носителя.
10. Проверка пригодности хроматографической
системы
Проверка пригодности системы является составной
частью многих аналитических методик. Этот тест основан
на представлении о том, что оборудование,
электроника, аналитические операции и анализируемые
образцы составляют единую систему, которую
можно исследовать как целое. Параметры, вводимые
в тест «Проверка пригодности хроматографической
системы», зависят от используемого метода анализо
и обосновываются исследованиями по робастности.
С. ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК -
ОСОБЕННОСТИ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ К МЕТОДАМ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫМ В ФАРМАКОПЕЕ
1. Оптическое вращение (2.2.7)
1.1. Введение. Выбирают растворитель, позволяющий
получать максимально возможный угол вращения.
Исследуют стабильность угла вращения испытуемого
раствора в течение не менее 2 ч. При необходимости
указывают, что раствор используют свежеприготовленным.
В необходимых случаях указывают
время достижения стабильного значения угла вращения.
Там, где возможно, используют D-линию натрия.
1.2. Идентификация. Если испытуемое вещество
представляет собой энантиомер, то для идентификации
используют удельный показатель оптического вращения.
Если удельный показатель оптического вращения используют
только для целей идентификации, то его значение
можно не пересчитывать на сухое вещество.
Регламентируемые пределы величины удельного показателя
должны учитывать допустимые пределы количественного
содержания анализируемого вещества
и чистоту образцов различного происхождения, которые
выдерживают требования соответствующей монографии.
Если удельный показатель оптического вращения используется
также и для контроля чистоты энантиоме-
ров, то испытание раздела «Идентификация» может
содержать ссылку: выдерживает требования испытания
«Удельное оптическое вращение».
1.3. Испытания. Удельный показатель оптического
вращения (в отдельных случаях угол вращения) может
быть использован для подтверждения оптической чистоты
энантиомера. Этот метод менее чувствителен,
чем метод жидкостной хроматографии (ЖХ). В случае,
когда измерение удельного оптического вращения
предназначено для того, чтобы нормировать содержание
одного из энантиомеров, необходимо показать,
что в условиях методики анализируемый энантиомер
имеет достаточную величину оптического вращения,
чтобы быть обнаруженным. Результат определения
представляют в пересчете на сухое вещество. Там,
где это возможно, представляют данные о влиянии
потенциальных примесей. Пределы удельного показателя
оптического вращения устанавливают с учетом
возможного содержания примесей. При отсутствии
информации об оптическом вращении примесей обычно
устанавливают пределы отклонения + 5 % от среднего
значения, полученного на образцах, отвечающих
всем остальным требованиям частной статьи. Там,
где это возможно, исследуют образцы различного
происхождения. Полезно также исследовать образцы
со сроками пригодности, близкими к предельному.
Измерение оптического вращения может использоваться
для подтверждения того, что субстанция является
рацематом. В таких случаях обычно устанавливают
пределы от (- 0.10) 0 до (+ 0.10) с.
1.4. Количественное определение. Оптическое
вращение может использоваться для количественного
определения субстанции. При этом необходимо использовать
стандартный образец с известной оптической
чистотой.
2. Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой
и видимой областях спектра
(2.2.25)
Должна быть доказана пригодность выбранных условий
определения, таких как используемые растворители
и их качество, рН раствора и т. д.
Обычно ультрафиолетовая спектрофотометрия имеет
ограниченную специфичность, которую можно -повысить
использованием первой и второй производной
спектра.
2 . 1 . Идентификация. Ультрафиолетовая спектрофотометрия
сама по себе редко используется для
идентификации. Когда этот метод включают в набор
испытаний для идентификации, необходимо изучить его
специфичность путем сравнения спектров анализируемого
вещества со спектрами подобных соединений.
Специфичность метода можно повысить, если использовать
не абсолютные значения оптических плотностей,
а спектральные отношения.
2.2. Испытания на предельное содержание
примесей. Если ультрафиолетовая спектрофотометрия
используется в испытаниях на допустимые пределы
содержания примесей, следует показать, что анализируемые
примеси дают достаточный вклад в измеряемую
оптическую плотность. При выбранной длине
волны должна быть установлена оптическая плотность,
соответствующая нормируемой концентрации анализируемой
примеси.
2.3. Количественное определение. Если ультрафиолетовая
спектрофотометрия используется для количественного
определения, то следует оценить влияние
примесей на светопоглощение. При количественном
определении не рекомендуется использовать удельный
показатель поглощения. Если удельный показатель
поглощения все же применяется, то его значение следует
устанавливать на основании межлабораторного
исследования, используя серии с известной чистотой.
Чистота этих образцов должна оцениваться с использованием
различных методов, включающих как методы
разделения, так и абсолютные методы (не требующие
использования стандартного образца).
3. Неинструментальные испытания на чистоту
и предельное содержание примесей
3 . 1 . Внешний вид раствора (2.2.1 и 2.2.2). Это
визуальные испытания, предназначенные для оценки
общей чистоты субстанции и основанные на сравнении
окраски (или опалесценции) испытуемого раствора
и серии растворов сравнения. Часто неизвестно,
какие примеси и в какой концентрации обусловливают
окраску или опалесценцию. В этом случае валида-
ция основывается на сопоставлении данных, полученных
для разных серий, представленных производителем
(или производителями). Если примеси известны и
доступны, валидацию этого метода проводят путем
сравнения более совершенным методом.
3.2. Кислотность и щелочность. Это неспецифичное
испытание является одной из характеристик чистоты
образца и используется для контроля протеоли-
тических примесей.
3.3. Испытания на предельное содержание
анионов и катионов (2.4). Пригодность этих испытаний
следует доказать путем использования метода
добавок и/или сравнения с другими, более совершенными
методами.
Сульфатная зола (2.4.14). Это испытание предназначено
для определения суммы катионов металлов, присутствующих
в органических субстанциях, но не подходит
для неорганических солей органических соединений.
Обычно предел не должен превышать 0.1 %.
Этот метод не требует валидации.
Тяжелые металлы (2.4.8). Применяют различные способы
проведения этого испытания. Обычно предел
содержания тяжелых металлов составляет 0.001 %
(10 млн-') или 0.002 %(20 млн;), но иногда и 0.0005 %
(5 млн'), что находится вблизи предела обнаружения.
Для валидации испытания на тяжелые металлы анализируют
испытуемый образец и образец, специально
загрязненный сзинцом соответствующей концентрации.
Окраска испытуемого образца должна быть меньше,
о загрязненного образца - равной или большей,
чем окраска раствора "сравнения.
Для ряда методик, требующих сжигания образца, существует
опасность потерь некоторых тяжелых металлов
(таких как, например, ртуть и свинец в присутствии
хлоридов). В таких случаях, когда это возможно,
контролируют содержание тяжелых металлов методом
атомно-абсорбционной спектрометрии или другим
инструментальным методом.
Если известно, что при синтезе субстанции используется
катализатор, например, палладий, никель или
родий, то их содержание целесообразно контролировать
колориметрическими или инструментальными
методами (например, ато.мно-абсорбционная спектрометрия
и др.)
Цветные реакции или реакции осаждения. Для отдельных
катионов и анионов описаны предельные испытания,
основанные на визуальном сравнении окраски
или опалесценции. При этом необходимо доказать,
Ч Т О ' .
- окраска или опалесценция для нормируемых
концентраций отчетливо видны;
- найденная концентрация добавленного иона
одинакова как для испытуемого раствора, так и для
раствора сравнения (как визуально, так и с помощью
методов, основанных на измерении поглощения);
- значения оптической плотности растворов, содержащих
50 %, 100 % и 150 % анализируемой примеси
от нормируемой концентрации, должны значимо
различаться;
- определение примеси на уровне нормируемой
концентрации проводят не менее шести раз и вычисляют
стандартное отклонение. Найденная концентрация
должна составлять не менее 80 % от введенной,
а относительное стандартное отклонение - не более
20 %.
Целесообразно провести сравнение результатов предельного
испытания с результатами количественного
определения с использованием независимого метода,
например, атомно-абсорбционной спектрофото-
метрии для катионов или ионной хроматографии для
анионов. Результаты, полученные двумя методами,
должны быть близки.
4. Атомно-абсорбционная спектрометрия
(2.2.23)
Метод атомно-абсорбционной спектрометрии (AAC)
применяют для испытаний по определению содержания
отдельных элементов, присутствующих в образце.
4 . 1 . Специфичность. Специфичность данного метода
определяется тем, что атомы анализируемого
элемента поглощают характеристическое излучение
от источника со строго дискретными длинами волн,
соответствующими данному элементу. Однако возможны
помехи вследствие как оптических, так и химических
эффектов. Перед началом валидации необходимо
выявить пом.ехи такого рода и, если возможно, снизить
их влияние путем использования соответствующих
приемов.
Эти помехи могут привести к систематической погрешности
при использовании метода прямой калибровки
или к изменению чувствительности метода. Основным
источником погрешности в методе AAC являются погрешности,
связанные с процессом калибровки и мешающим
влиянием матрицы.
4.2. Калибровка. Использование линейной модели
калибровки описано в общей статье 2.2.23 «Атом-
но - абсорбционная спектрометрия». Для доказательства
применимости линейной регрессионной модели
рекомендуется использовать не менее пяти калибровочных
растворов. В некоторых случаях возможно использование
параболической модели калибровки. При
этом также используют не менее пяти калибровочных
растворов. Рекомендуется использовать концентрации
калибровочных растворов с равномерным распределением
внутри диапазона применения.
Для каждой концентрации рекомендуется выполнять
не менее пяти измерений.
Проблемы с калибровкой часто могут быть выявлены
визуально. Однако калибровочные графики сами по
себе нельзя использовать как доказательство пригодности
метода калибровки. Калибровочный график
представляют в следующем виде:
a) На графике откладывают измеренные оптические
плотности как функции концентраций и строят
кривую, описывающую эту калибровочную функцию,
вместе с ее доверительными интервалами.
Экспериментальные точки должны находиться в
пределах доверительного интервала построенной
кривой.
b) На графике откладывают остаточные отклонения
(разности между измеренными и вычисленными
по калибровочному графику оптическими плотностями)
как функции концентрации. Эти разности
должны распределяться вокруг оси абсцисс случайным
образом.
В некоторых случаях разброс значений сигнала возрастает
с ростом концентрации, что может быть выявлено
из графика остаточных отклонений или статистическими
методами. При этом наибольшая точность
может быть достигнута при использовании калибровки
с массовыми множителями. Может быть применена
как линейная, так и квадратичная массовая функция.
В случае использования массовой модели строится
график разностей масс (т.е. разностей, умноженных
на массы) как функции концентрации следующим образом:
a) На графике откладывают измеренные оптические
плотности как массовые функции концентраций
и строят кривую, описывающую эту калибровочную
функцию вместе с ее доверительными интерволами.
b) На графике откладывают массовые остаточные
отклонения (т.е. разности масс между измеренными
и вычисленными по калибровочному графику
оптическими плотностями) как функции концентрации.
Необходимо показать, что модель достаточно точно
описывает экспериментальные данные.
4.3. Эффекты матрицы. Если для получения калибровочной
функции используют метод калибровочной
кривой, то необходимо показать, что чувствительность
для раствора анализируемого образца и калибровочных
растворов одинакова.
Если применяется калибровка в виде прямой линии,
различия в чувствительности могут быть обнаружены
путем сравнения наклонов калибровочной прямой,
полученной с использованием стандартных растворов,
и растворов, полученных внесением стандартной добавки
к испытуемому раствору. Точность оценки наклонов
обеих прямых зависит от числа и распределения
точек измерения. Поэтому для построения обоих
регрессионных линий рекомендуется использовать
достаточное число точек (не менее пяти) и выбирать
концентрации преимущественно на границах диапазона
калибровки.
Обоснованием для возможности использования метода
калибровочной кривой является незначимость
различий наклонов полученных прямых по критерию
Стьюдента. Если различия значимы, то используют
метод стандартных добавок.
4.4. Предел обнаружения и предел количественного
определения (метод, основанный на
стандартном отклонении контрольного опыта
- см. 7.3.1 и 8 . 3 . 1 , раздел В). Выполняют контрольные
опыты, для которых предпочтительно использовать
растворы «плацебо», содержащие все компоненты
образца, за исключением определяемого. Если
такие контрольные опыты выполнить невозможно, то
допустимо использовать холостые растворы, содержащие
все реагенты и приготовленные так же, как и
испытуемый раствор.
5. Разделительные методы
5 . 1 . Хроматографические методы. Различные
хроматографические методы могут использоваться для
идентификации, контроля примесей и количественного
определения. Ниже описаны особенности валидации
данных методов.
5 . 1 . 1 . Тонкослойная хроматография (2.2.27)
Специфичность. Для тестов идентификации обычно
нельзя добиться специфичности, используя только тонкослойную
хроматографию (TCX) саму по себе, однако
достаточная избирательность может быть достигнута
при сочетании TCX с другими методами. Если для
предельного испытания избирательность недостаточна,
то используют дополнительное испытание (испытания)
для контроля примеси (примесей), зона которой
не была отделена от других зон. Необходимо
доказать избирательность совокупности используемых
методик. Для испытаний идентификации улучшение
избирательности может быть достигнуто при использовании
опрыскивания реактивом, который позволяет
различать близкие соединения по цвету.
Неподвижная фаза. Необходимо показать, что данное
испытание пригодно для проведения анализа на
пластинках одного типа, но различного происхождения.
Тест «Проверка пригодности хроматографической
системы». Такой тест обычно проводится
для подтверждения разделения двух близко элюирую-
щихся соединений, одним из которых является анализируемое
вещество. Необходимо доказать, что разделение
выбранных соединений гарантирует пригодность
системы для достижения поставленных целей.
Для испытаний на предельное содержание примесей
необходимо учитывать следующее:
Обнаружение. Необходимо избегать использова-
ние особых опрыскивающих реагентов, если в методике
не используется стандарт нормируемой примеси.
Предел обнаружения. Если используют количественную
инструментальную методику, то для определения
предела обнаружения используют подходы, описанные
в пункте 7 раздела В. Если используют визуальную
методику, то необходимо показать, что обнаруживается
количество, соответствующее указываемому
пределу обнаружения.
Коэффициент пересчета. Если примеси доступны,
то необходимо показать, что чувствительности определения
примеси и основного вещества близки. Для
испытаний на допустимые пределы примесей различия
в чувствительностях могут быть показаны путем
сравнения пределов обнаружения.
Предел количественного определения, линейность,
диапазон и сходимость. Эти данные необходимо
представлять при использовании инструментальной
количественной ТСХ.
5.1.2. Жидкостная хроматография (2.2.29)
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Специфичность. Для испытаний идентификации обычно
нельзя добиться специфичности, используя только
жидкостную хроматографию саму по себе, однако
достаточная избирательность может быть достигнута
при сочетании жидкостной хроматографии с другими
методами. Избирательность должна быть показана для
времен удерживания, относительных времен удерживания
или для коэффициентов емкости для анализируемого
вещества и близких по строению Ееществ. Эти
данные необходимо представлять для нескольких стационарных
фаз одного типа.
ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ
ПРИМЕСЕЙ
Специфичность. Избирательность разделения. Должно
быть показано разделение известных и возможных
примесей с основным веществом и, если возможно,
между собой. Специфичность может быть подтверждена
при использовании для детектирования масс-
спектрометра. Прим.еси, не отделяющиеся от основного
вещества, должны контролироваться другим методом.
Необходимо представлять данные о времени
удерживания, относительнолл времени удерживания или
коэффициенте емкости для основного вещества и примесей.
Эти данные должны предоставляться для нескольких
стационарных фаз одного типа
Избирательность детектирующей системы. Выбор детектора
и условий детектирования должен быть обоснован.
Специфичность может быть подтверждена.
например, при использовании для детектирования
масс-спектрометра.
Коэффициент пересчета. Если примеси доступны,
то необходимо показать, что чувствительности определения
примеси и-основного вещества близки (при
использовании УФ-детектирования - при выбранной
длине волны детектирования; это необходимо показать
и для других типов детекторов - например, рефрактометрического
или кондуктометрического). Если
отношение чувствительностей известной примеси и
основного вещества выходит за пределы 0.8 - 1.2 и
если допустимый предел содержания этой примеси
больше 0.1 %, то необходимо использовать коэффициент
пересчета либо стандарт нормируемой примеси
в варианте внешнего стандарта.
Предел обнаружения или количественного
определения. Эти пределы должны определяться для
метода внешнего стандарта при использовании разведений
испытуемой субстанции или при использовании
стандарта примеси. Если пик примеси выходит в
непосредственной близости от пика субстанции (особенно
если непосредственно за ним), то предел обнаружения
или количественного определения должен
устанавливаться по этой примеси. Метод, описанный
в пункте 7 раздела В, пригоден для вычисления обоих
указанных пределов.
Стабильность. Необходимо представлять данные,
подтверждающие срок хранения испытуемого раствора
и раствора сравнения. Также должны представляться
данные о стабильности подвижной фазы.
Степень извлечения. При использовании экстракции
необходимо изучить степень извлечения известных
и доступных примесей при оптимальных условиях.
Необходимо представить данные, подтверждающие,
что экстракция обеспечивает достаточную точность.
Получение производных. Если используют пред-
или послеколоночное получение производных, необходимо
установить оптимальные условия реакции (время,
температура и др.) и исследовать стабильность
полученных производных.
Тест «Проверка пригодности хроматографической
системы». В соответствии с описанием для
ТСХ. Использование соотношения сигнал/шум требуется
только тогда, когда предел определения и нормируемый
предел содержания примеси близки.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Специфичность. Это желательное, но не основное
требование. Если метод не специфичен, то возможность
его использования обеспечивается низким уровнем
содержания примесей, которые контролируются
другим испытанием.
ПО
Тест «Проверка пригодности хроматографической
системы». В соответствии с описанием для
тех.
5 . 3 . 1 . Газовая хроматография (2.2.29)
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Специфичность. В соответствии с описанием для
жидкостной хроматографии.
ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ
ПРИМЕСЕЙ
Специфичность. В соответствии с описанием для
жидкостной хроматографии
Коэффициент пересчета. В соответствии с описанием
для жидкостной хроматографии. Должны представляться
коэффициенты пересчета нормируемой
примеси относительно основного вещества. Это особенно
важно при использовании селективных детекторов,
таких как детектор по электронному захвату и
т. п.
Пределы обнаружения и количественного
определения. В соответствии с описанием для жидкостной
хроматографии.
Стабильность. В соответствии с описанием для жидкостной
хроматографии.
Получение производных. В соответствии с описанием
для жидкостной хроматографии.
Внутренний стандарт. Необходимо показать, что
при выбранных условиях пик внутреннего стандарта
не перекрывается с пиками возможных примесей или
основного вещества.
Степень извлечения. В соответствии с описанием
для жидкостной хроматографии.
ТЕСТ «ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ
СИСТЕМЫ»
Отношение Сигнал/Шум. Обычно определяют для
сигналов, равных или несколько больших, чем предел
обнаружения и предел количественного определения.
Степень разделения. Определяют для пика анализируемого
вещества и ближайшего пика примеси
или для пика анализируемого вещества и пика внутреннего
стандарта. Если коэффициент симметрии отличается
от принятого диапазона (0.8-1.2), целесообразно
нормировать его пределы (2.2.29). Это особенно
важно для тех случаев, когда используются набивные
колонки или пик нормируемой примеси элюиру-
ется непосредственно за пиком основного вещества.
Там, где возможно, подтверждают выполнение испытания
с использованием колонок подобного типа.
Метод анализа равновесной паровой фазы.
Этот метод применяют для анализа легколетучих веществ.
Необходимо показать, что выбранные температура
и время предварительного нагрева сосудов с
анализируемым образцом обеспечивают установление
равновесия. Следует изучить влияние матрицы.
Валидация метода заключается в проведении повторных
анализов образца. При этом после каждого введения
пробы газовая фаза в сосуде замещается и сосуды
снова уравновешиваются перед новым вводом газовой
фазы. По полученным данным строят график
зависимости логарифмов площадей пиков анализируемого
вещества от числа экстракций и рассчитывают
его характеристики. Близость коэффициента корреляции
полученной зависимости к 1.0 свидетельствует
о правильности выбора условий испытания. Эффекты
влияния матрицы можно устранить при использовании
метода стандартных добавок.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Специфичность. В соответствии с описанием для
жидкостной хроматографии.
Тест «Проверка пригодности системы». В соответствии
с описанием для жидкостной хроматографии.
Ниже приводятся некоторые особенности, которые
необходимо учитывать для данного тесто.
2.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ
2.3.1. РЕАКЦИИ ИДЕНТИФИКАЦИИ
НА ИОНЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ
ГРУППЫ
АЛКАЛОИДЫ
Несколько миллиграммов или указанное в частной
статье количество испытуемой субстанции растворяют
в 5 мл воды Р, прибавляют кислоту' хлороводородную
разбавленную P до кислей реакции раствора
(2.2.4), затем 1 мл растворе калия йодвисмутата
Р; тотчас образуется оранжевый или оранжево-красный
осадок.
АЛЮМИНИЙ
Около 15 мг испытуемой субстанции растворяют в
2 мл воды Р. К полученному раствору или к 2 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
0.5 мл кислоты хлороводородной разбавленной P и
около 0.5 мл реактива тиоацетомида Р; осадок не
образуется. Затем прибавляют по каплям раствор
натрия гидроксида разбавленный Р; образуется геле-
образный белый осадок, растворяющийся при последующем
прибавлении раствора натрия гидроксида
разбавленного Р. К полученному раствору постепенно
прибавляют раствор аммония хлорида P1 вновь
образуется гелеобразный белый осадок.
АМИНЫ АРОМАТИЧЕСКИЕ ПЕРВИЧНЫЕ
Испытуемый раствор, указанный в частной статье,
подкисляют кислотой хлороводородной разбавленной
Р, прибавляют 0.2 мл раствора натрия нитрита P и
через 1-2 мин прибавляют 1 мл раствора . -нафтола
Р; появляется интенсивно оранжевое или красное
окрашивание и, как правило, образуется осадок такого
же цвета.
АММОНИЯ СОЛИ
К испытуемому раствору, указанному в частной статье,
прибавляют 0.2 г магния оксида Р. Через жидкость
пропускают ток воздуха и выходящий газ направляют
в смесь 1 мл 0.1 M кислоты хлороводородной
и 0.05 мл раствора метилового красного Р; окраска
индикатора переходит в желтую. Затем прибавляют
1 мл свежеприготовленного раствора
100 г/л натрия кобальтинитрита Р; образуется желтый
осадок.
АММОНИЯ СОЛИ И СОЛИ ЛЕТУЧИХ ОСНОВАНИЙ
Около 20 мг испытуемой субстанции растворяют в
2 мл воды Р. К полученному раствору или к 2 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
2 мл раствора натрия гидроксида разбавленного Р.
При нагревании раствора выделяются пары, которые
обнаруживаются по запаху и щелочной реакции
(2.2.4).
АЦЕТАТЫ
a) Испытуемую субстанцию нагревают с равным количеством
кислоты щавелевой Р; выделяется кислота
уксусная, обнаруживаемая по запаху и кислой реакции
(2.2.4).
b) Около 30 мг испытуемой субстанции растворяют в
3 мл воды Р. К полученному раствору или к 3 мл
раствора, указанного в частной статье, последовательно
прибавляют 0.25 мл раствора лантана нитрата
Р, 0.1 мл 0.05 M раствора йода и 0.05 мл раствора
аммиака разбавленного Р2. Смесь осторожно
нагревают до кипения; в течение нескольких минут
образуется синий осадок или появляется синее окрашивание.
с) К 2 мл нейтрального раствора, содержащего испытуемую
субстанцию в количестве, эквивалентном
около 20-60 мг ацетат-иона (СН.СОО), прибавляют
0.2 мл раствора 30 г/л железа(Ш) хлорида Р; появляется
красно-бурое окрашивание, исчезающее при
прибавлении кислот минеральных разбавленных.
с!) 2 мл раствора, содержащего испытуемую субстанцию
в количестве, эквивалентном около 20-60 мг ацетат-
иона (CH3COO"), нагревают с равным количеством
кислоты серной концентрированной P и 0.5 мл 96 %
спирта Р; образуется этилацетат, обнаруживаемый по
запаху.
АЦЕТИЛ
Около 15 мг или указанное в частной статье количество
испытуемой субстанции помещают в пробирку
длиной около 180 мм и наружным диаметром 18 мм
и прибавляют 0.15 мл кислоты фосфорной Р. Пробирку
закрывают пробкой, через которую пропущена
небольшая пробирка длиной около 100 мм и наружным
диаметром 10 мм, содержащая воду Pu вы-
полняющоя роль холодильника. На внешнюю поверхность
меньшей пробирки помещают 1 каплю раствора
лантана нитрата Р. Если субстанция относительно
легко гидролизуется, устройство помещают на 5 мин
в водяную баню, затем вынимают меньшую пробирку.
Для трудно гидролизуемых субстанций смесь медленно
нагревают на открытом пламени до кипения.
Каплю снимают, смешивают на фарфоровой пластинке
с 0.05 мл 0.01 M раствора йода. На край капли
наносят 0.05 мл раствора аммиака разбавленного
Р2; через 1-2 мин в месте соединения двух капель
появляется синее окрашивание, которое усиливается
и сохраняется в течение короткого промежутка времени.
БАРБИТУРАТЫ (ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ
.-ЗАМЕЩЕННЫХ)
Около 5 мг испытуемой субстанции растворяют в 3 мл
метанола Р, прибавляют 0.1 мл раствора, содержащего
100 г/л кобальта нитрата P и 100 г/л кальция
хлорида Р, перемешивают и прибавляют при встряхивании
0.1 мл раствора натрия гидроксида разбавленного
P1 появляется фиолетово-синее окрашивание
и образуется осадок.
БЕНЗОАТЫ
a) К 1 мл раствора, указанного в частной статье,
прибавляют 0.5 мл раствора железа(Ш) хлорида Pl;
образуется бледно-желтый осадок, растворимый в
эфире Р.
b) 0.2 г испытуемой субстанции, при необходимости
измельченной, помещают в пробирку, смачивают
0.2 мл или 0.3 мл кислоты серной Р, осторожно нагревают
дно пробирки; на внутренних стенках пробирки
появляется белый налет.
c) 0.5 г испытуемой субстанции растворяют в 10 мл
воды Р. К полученному раствору или к 10 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 0.5 мл
кислоты хлороводородной Р; образуется осадок, который
после перекристаллизации из теплой воды P и
высушивания в вакууме имеет температуру плавления
(2.2.14/ от 120 0C до 124 0C
БРОМИДЫ
а) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 3 мг бромид-иона (Br), растворяют в 2 мл воды
Р. Полученный раствор или 2 мл раствора, указанного
в частной статье, подкисляют кислотой азотной
разбавленной P1 прибавляют 0.4 мл раствора серебра
нитрата Pl, перемешивают и отстаивают; образуется
светло-желтый творожистый осадок. Осадок отделяют
центрифугированием и промывают тремя порциями
воды P по 1 мл каждая. Эти операции проводят
быстро в защищенном от яркого света месте, при
этом допускается, чтобы жидкость над осадком не была
полностью прозрачной. Полученный осадок суспендируют
в 2 мл воды Я и прибавляют 1.5 мл раствора
аммиака Р; осадок медленно растворяется.
Ь) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 5 мг бромид-иона (Br"), или количество субстанции,
указанное в частной статье, помещают в небольшую
пробирку, прибавляют 0.25 мл воды Р, около
75 мг свинца(1У) оксида Р, 0.25 мл кислоты уксусной
P и осторожно встряхивают. Верхнюю внутреннюю
часть пробирки высушивают с помощью фильтровальной
бумаги и оставляют на 5 мин. Полоску фильтровальной
бумаги необходимого размера импрегниру-
ют, помещая ее край в каплю раствора фуксина обесцвеченного
P и тотчас помещают импрегнированную
часть в пробирку. В течение 10 с у нижнего края
фильтровальной бумаги появляется фиолетовое окрашивание,
которое четко отличается от красной окраски
фуксина, наблюдаемой в верхней импрегниро-
ванной части полоски бумаги.
с) К 1 мл раствора, содержащего испытуемую субстацию
в количестве, эквивалентном около 2-30 мг
бромид-иона (Br"), прибавляют 1 мл кислоты хлороводородной
разбавленной Р, 0.5 мл раствора 50 г/л
хлорамина /°(свежеприготовленного), 1 мл хлороформа
P и взбалтывают; хлороформный слой приобретает
желто-бурую окраску.
ВИСМУТ
a) 0.5 г испытуемой субстанции растворяют в 10 мл
кислоты хлороводородной разбавленной Р. Полученный
раствор или 10 мл раствора, указанного в частной
статье, кипятят в течение 1 мин, охлаждают и при
необходимости фильтруют. К 1 мл полученного раствора
прибавляют 20 мл воды Р; образуется белый
или светло-желтый осадок, цвет которого после прибавления
от 0.05 мл до 0.1 мл раствора натрия сульфида
P изменяется на коричневый.
b) Около 45 мг испытуемой субстанции растворяют в
10 мл кислоты азотной разбавленной Р. Полученный
раствор или 10 мл раствора, указанного в частной
статье, кипятят в течение 1 мин, охлаждают и при
необходимости фильтруют. К 5 мл полученного ра-
створа прибавляют 2 мл раствора 100 г/л тиомоче-
вины Р; появляется желтовато-оранжевое окрашивание
или образуется оранжевый осадок. Затем прибавляют
4 мл раствора 25 г/л натрия фторида Р;
раствор не обесцвечивается в течение 30 мин.
ЖЕЛЕЗО
a) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 10 мг железа-иона (Fe2+), растворяют в 1 мл
воды Р. К полученному раствору или к 1 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 1 мл
раствора калия феррицианида Р; образуется синий
осадок, не растворяющийся при прибавлении кислоты
хлороводородной разбавленной Р.
b) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 1 мг железа-иона (Fe3+), растворяют в 30 мл
воды Р. К полученному раствору или к 3 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 1 мл
кислоты хлороводородной разбавленной P и 1 мл
раствора калия тиоционата Р; появляется красное
окрашивание. Отбирают две порции полученного
раствора по 1 мл каждая. К одной порции прибавляют
5 мл спирта изоамилового P или 5 мл эфира P1
встряхивают и оставляют до расслоения; органический
слой окрашивается в розовый цвет. К другой порции
прибавляют 2 мл раствора ртути(Н) хлорида Р;
красное окрашивание раствора исчезает.
c) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную не
менее 1 мг железа-иона (FeJ+), растворяют в 1 мл воды
Р. К полученному раствору или к 1 мл раствора, указанного
в частной статье, прибавляют 1 мл раствора
калия ферроцианида Р; образуется синий осадок, не
растворяющийся при прибавлении 5 мл кислоты хлороводородной
разбавленной Р.
ЙОДИДЫ
a) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 4 мг йодид-иона (Г), растворяют в 2 мл воды Р.
Полученный раствор или 2 мл раствора, указанного
в частной статье, подкисляют кислотой азотной разбавленной
P1 прибавляют 0.4 мл раствора серебра
нитрата Pl, перемешивают и отстаивают до образования
светло-желтого творожистого осадка. Осадок
отделяют центрифугированием и промывают 3
порциями воды Pпо . мл каждая. Эту операцию проводят
быстро в защищенном от яркого света месте,
при этом допускается, чтобы жидкость над осадком
не была полностью прозрачной. Осадок суспендируют
в 2 мл воды P и прибавляют 1.5 мл раствора аммиака
Р; осадок не растворяется.
b) К 0.2 мл раствора испытуемой субстанции, содержащей
около 5 мг йодид-иона (I ') в 1 мл, или к 0.2 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
0.5 мл кислоты серной разбавленной Р, 0.1 мл раствора
калия дихромата Р, 2 мл воды P1 2 мл хлороформа
Р, встряхивают в течение нескольких секунд и
оставляют до расслоения; хлороформный слой приобретает
фиолетовую или фиолетово-красную окраску.
КАЛИЙ
a) 0.1 г испытуемой субстанции растворяют в 2 мл
воды Р. К полученному раствору или к 2 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 1 мл
раствора натрия карбоната P и нагревают; осадок
не образуется. К горячему раствору прибавляют
0.05 мл раствора натрия сульфида Р; осадок не образуется.
Раствор охлаждают в ледяной воде, прибавляют
2 мл раствора 150 г/л кислоты винной Pn
отстаивают; образуется белый кристаллический осадок.
b) Около 40 мг испытуемой субстанции растворяют в
1 мл воды Р. К полученному раствору или к 1 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
1 мл кислоты уксусной разбавленной P и 1 мл свежеприготовленного
раствора 100 г/л натрия кобаль-
тинитрита P1 тотчас образуется желтый или оранжево-
желтый осадок.
с) Соль калия, внесенная в бесцветное пламя, окрашивает
его в фиолетовый цвет или при рассматривании
через синее стекло - в пурпурно-красный.
КАЛЬЦИЙ
a) К 0.2 мл нейтрального раствора, содержащего
испытуемую субстанцию в количестве, эквивалентном
около 0.2 мг кальций-иона (Ca2+) в 1 мл, или к 0.2 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
0.5 мл раствора 2 г/л глиоксальгидроксианила P в
спирте Р, 0.2 мл раствора натрия гидроксида разбавленного
P и 0.2 мл раствора натрия карбоната Р.
Смесь встряхивают с 1 мл или 2 мп хлороформа Pu
прибавляют от 1 мл до 2 мл воды Р; хлороформный
слой приобретает красную окраску.
b) Около 20 мг или указанное в частной статье количество
испытуемой субстанции растворяют в 5 мл
кислоты уксусной Р. К полученному раствору прибавляют
0.5 мл раствора калия ферроцианида Р: раствор
остается прозрачным. К раствору прибавляют около
50 мг аммония хлорида Р, образуется белый кристаллический
осадок.
c) К 1 мл раствора, содержащего испытуемую субстанцию
в количестве 2-20 мг кальций-иона (Ca2+),
прибавляют 1 мл раствора 40 г/л аммония оксала-
та Р; образуется белый осадок, нерастворимый в кислоте
уксусной разбавленной P и растворе аммиака
Р, растворимый в разведенных минеральных кислотах.
d) Соль кальция, смоченная кислотой хлороводородной
P и внесенная в бесцветное пламя, окрашивает
его в оранжево-красный цвет.
КАРБОНАТЫ И ГИДРОКАРБОНАТЫ
а) 0.1 г испытуемой субстанции помещают в пробирку
и суспендируют в 2 мл воды Р. К полученной суспензии
или к 2 мл суспензии, указанной в частной
статье, прибавляют 3 мл кислоты уксусной разбавленной
Р. Пробирку тотчас закрывают притертой
пробкой со стеклянной трубкой, дважды изогнутой под
прямым углом; наблюдается бурное выделение пузырьков
газа без цвета и запаха. Пробирку осторожно
нагревают и пропускают выделяющийся газ через 5 мл
раствора бария гидроксида Р; образуется белый осадок,
растворяющийся при прибавлении избытка кислоты
хлороводородной PL
Ь) 0.2 г испытуемой субстанции растворяют в 2 мл
воды Р. К полученному раствору прибавляют 0.5 мл
насыщенного раствора магния сульфата Р; образуется
белый осадок (отличие от гидрокарбонатов, растворы
которых образуют осадок только при кипячении
смеси).
Примечание. Для получения насыщенного раствора
магния сульфата, к 100 г магния сульфата P прибавляют
100 мл воды P и оставляют на 24 ч при частом
взбалтывании. Раствор фильтруют.
с) 0.2 г испытуемой субстанции растворяют в 2 мл
воды Р. К полученному раствору прибавляют 0.05 мл
раствора фенолфталеина Р; появляется красное окрашивание
(отличие от гидрокарбонатов, растворы
которых остаются бесцветными).
КСАНТИНЫ
К нескольким миллиграммам или к указанному в частной
статье количеству испытуемой субстанции прибавляют
0.1 мл раствора пероксида водорода концентрированного
Р, 0.3 мл кислоты хлороводородной
разбавленной P и упаривают на водяной бане до
получения сухого желтовато-красного остатка. К остатку
прибавляют 0.1 мл аммиака разбавленного Р2;
цвет остатка изменяется на красно-фиолетовый.
ЛАКТАТЫ
Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную около
5 мг кислоты молочной, растворяют в 5 мл воды
Р. К полученному раствору или к 5 мл раствора, указанного
в частной статье, прибавляют 1 мл бромной
воды P1 0.5 мл кислоты серной разбавленной P и
нагревают на водяной бане, периодически перемешивая
стеклянной палочкой, до обесцвечивания раствора.
К раствору прибавляют 4 г аммония сульфата
P ., перемешивают, прибавляют по каплям, не перемешивая,
0.2 мл раствора 100 г/л натрия нитро-
пруссида P в кислоте серной разбавленной P1 осторожно
прибавляют, также не перемешивая, 1 мл раствора
аммиака концентрированного P и отстаивают
в течение 30 мин; на границе двух жидкостей образуется
темно-зеленое кольцо.
МАГНИЙ
Около 15 мг испытуемой субстанции растворяют в
2 мл воды Р. К полученному раствору или к 2 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
1 мл раствора аммиака разбавленного Pl·, образуется
белый осадок, растворяющийся при прибавлении
1 мл раствора аммония хлорида Р. К полученному
раствору прибавляют 1 мл раствора натрия гидрофосфата
P) образуется белый кристаллический
осадок.
МЫШЬЯК
а) 5 мл испытуемого раствора нагревают на водяной
бане с равным объемом реактива гипофосфита Р;
образуется коричневый осадок.
b) Мышьяк(Ш) /орсениты). К 0.3 мл раствора, содержащего
испытуемую субстанцию в количестве, эквивалентном
около 30 мг арсенит-иона (AsO1
3"), прибавляют
0.5 мл кислоты хлороводородной разбавленной
P и 0.1 мл раствора натрия сульфида Р; образуется
желтый осадок, нерастворимый в кислоте хлороводородной
концентрированной Р, растворимый в
растворе аммиака Р.
c) Мышьяк (V) (орсенаты). К 0.3 мл раствора, содержащего
испытуемую субстанцию в количестве, эквивалентном
около 1 мг арсенат-иона (AsO4
3"), прибавляют
по 1 мл раствора 100 г/л аммония хлорида Р,
раствора аммиака Pw раствора 100 г/л магния сульфата
Р; образуется белый кристаллический осадок,
растворимый в кислоте хлороводородной разбавленной
P (отличие от арсенитов).
НАТРИЙ
a) 0.1 г испытуемой субстанции растворяют в 2 мл
воды Р. К полученному раствору или к 2 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 2 мл
раствора 150 г/л калия карбоната P и нагревают до
кипения; осадок не образуется. К раствору прибавляют
4 мл раствора калия пироантимоната Pw нагревают
до кипения, затем охлаждают в ледяной воде и
при необходимости потирают внутренние стенки пробирки
стеклянной палочкой; образуется плотный осадок
белого цвета.
b) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 2 мг натрий-иона (Na+), растворяют в 0.5 мл
воды Р. К полученному раствору или к 0.5 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 1.5 мл
метоксифенилуксусной кислоты реактива Р, охлаждают
в ледяной воде в течение 30 мин; образуется
объемный белый кристаллический осадок. Смесь помещают
в воду при температуре 20 0C и перемешивают
в течение 5 мин; осадок не исчезает. К смеси
прибавляют 1 мл раствора аммиака разбавленного
Pl; осадок полностью растворяется. К полученному
раствору прибавляют 1 мл раствора аммония
карбоната Р; осадок не образуется.
НИТРАТЫ
а) Навеску порошка субстанции, эквивалентную около
1 мг нитрат-иона (NO3), или количество, указанное
в частной статье, прибавляют к смеси 0.1 мл нитробензола
Pw 0.2 мл кислоты серной Pw через 5 мин
охлаждают в ледяной воде. Продолжая охлаждение,
медленно при перемешивании прибавляют 5 мл воды
P1 5 мл раствора натрия гидроксида концентрированного
Р, 5 мл ацетона Р, взбалтывают и отстаивают;
верхний слой приобретает темно-фиолетовую
окраску.
b) Нитраты. Раствор, содержащий испытуемую субстанцию
в количестве, эквивалентном около 2 мг нитрат-
иона (NO3"), не обесцвечивает раствор 1 г/л калия
перманганота P1 подкисленный кислотой серной разбавленной
P (отличие от нитритов).
c) Нитриты. Несколько кристаллов антипирина растворяют
в фарфоровой чашке в 0.1 мл кислоты хлороводородной
разбавленной Р, прибавляют 0.1 мл раствора,
содержащего около 1 мг нитрит-иона (NO2');
появляется зеленое окрашивание (отличие от нитратов).
РТУТЬ
a) Около 0.1 мл раствора испытуемой субстанции
помещают на тщательно очищенную поверхность
медной фольги; появляется темно-серое пятно, которое
при натирании становится блестящим. Фольгу
высушивают и нагревают в пробирке; пятно исчезает.
b) К раствору, указанному в частной статье, прибавляют
раствор натрия гидроксида разбавленный P до
сильнощелочной среды (2.2.4); образуется плотный
осадок желтого цвета (соли ртути).
с) Соль натрия, смоченная кислотой хлороводородной
P и внесенная в бесцветное пламя, окрашивает
его в желтый цвет.
с) К 1 мл раствора, содержащего испытуемую субстанцию
в количестве, эквивалентном 10-30 мг ртуть-
иона (Hg2+), прибавляют осторожно по каплям раствор
калия йодида Р; образуется красный осадок,
растворимый в избытке этого реактива.
САЛИЦИЛАТЫ
a) К 1 мл раствора, указанного в частной статье,
прибавляют 0.5 мл раствора железа////) хлорида Pl;
появляется фиолетовое окрашивание, которое не исчезает
после прибавления 0.1 мл кислоты уксусной
P
b) 0.5 г испытуемой субстанции растворяют в 10 мл
воды Р. К полученному раствору или к 10 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 0.5 мл
кислоты хлороводородной Р. Полученный осадок после
перекристаллизации из горячей воды P и высушивания
в вакууме имеет температуру плавления (2.2. 14)
от 156 0C до 161 0C
СВИНЕЦ
a) 0.1 г испытуемой субстанции растворяют в 1 мл
кислоты уксусной Р. К полученному раствору или к
1 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют
2 мл раствора калия хромата Р; образуется
желтый осадок, растворяющийся при прибавлении
2 мл раствора натрия гидроксида концентрированного
Р.
b) 50 мг испытуемой субстанции растворяют в 1 мл
кислоты уксусной Р. К полученному раствору или к
1 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют
10 мл воды P и 0.2 мл раствора калия йодида
Р; образуется желтый осадок. Смесь кипятят в течение
1-2 мин; осадок растворяется. Раствору дают
остыть; вновь образуется осадок в виде блестящих
желтых пластинок.
СЕРЕБРО
Около 10 мг испытуемой субстанции растворяют в
10 мл воды Р. К полученному раствору или к 10 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
0.3 мл кислоты хлороводородной Pl; образуется белый
творожистый осадок, растворяющийся при прибавлении
3 мл раствора аммиака разбавленного Pl.
СИЛИКАТЫ
Количество испытуемой субстанции, указанное в частной
статье, смешивают в свинцовом или плстиновом
тигле с помощью медной проволоки с около 10 мг
натрия фторида P и несколькими каплями кислоты
серной P до образования суспензии. Тигель накрывают
тонкой прозрачной пластиковой пластинкой с
висящей каплей воды P и осторожно нагревают; через
короткий промежуток времени вокруг капли воды
появляется белое кольцо.
СУЛЬФАТЫ
a) Около 45 мг испытуемой субстанции растворяют в
5 мл воды Р. К полученному раствору или к 5 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
1 мл кислоты хлороводородной разбавленной P и
1 мл раствора бария хлорида Pl; образуется белый
осадок.
b) К суспензии, полученной в результате реакции (а),
прибавляют 0.1 мл 0.05 M раствора йода; желтая
окраска йода не исчезает (отличие от сульфитов и
дитионитов), но обесцвечивается при прибавлении по
каплям раствора олова хлорида P (отличие от йода-
тов). Смесь кипятят; осадок не окрашивается (отличие
от селенатов и вольфраматов).
СУЛЬФИТЫ
a) К 2 мл раствора, содержащего испытуемую субстанцию
в количестве, эквивалентном 10-30 мг сульфит-
иона (SO3
2'), прибавляют 2 мл кислоты хлороводородной
разбавленной P и встряхивают; постепенно
выделяется сернистый газ, обнаруживаемый по
характерному резкому запаху.
b) К указанному в частной статье раствору, содержащему
сульфит-ион (SO3
2'), прибавляют 0.1 мл 0.05 M
раствора йода; реактив обесцвечивается.
СУРЬМА
Около 10 мг испытуемой субстанции растворяют при
нагревании в растворе 0.5 г калия-натрия тартрата
P B 10 мл воды P и охлаждают. К 2 мл полученного
раствора или к 2 мл раствора, указанного в частной
статье, прибавляют по каплям раствор натрия сульфида
Р; образуется оранжево-красный осадок, растворяющийся
при прибавлении раствора натрия гидроксида
разбавленного Р.
ТАРТРАТЫ
а) Около 15 мг испытуемой субстанции растворяют в
5 мл воды Р. К полученному раствору или к 5 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
0.05 мл раствора 10 г/л железо)/!) сульфата P и
0.05 мл раствора перокси да водорода разбавленного
Р; появляется неустойчивое желтое окрашивание.
После обесцвечивания раствора к нему прибавляют
по каплям раствор натрия гидроксида разбав-
ленный Р; появляется интенсивное синее окрашивание.
Ы К 0.1 мл раствора испытуемой субстанции, эквивалентного
около 15 мг/мл кислоты винной, или к 0.1 мл
раствора, указанного в частной статье, прибавляют
0.1 мл раствора 100 г/л калия бромида Р, 0.1 мл
раствора 20 г/л резорцина Р, 3 мл кислоты серной
P и нагревают на водяной бане от 5 мин до 10 мин;
появляется темно-синее окрашивание. Раствор охлаждают
и вливают в воду P) окраска раствора изменяется
на красную.
ФОСФАТЫ (ОРТОФОСФАТЫ)
а) К 5 мл раствора, указанного в частной статье, при
необходимости нейтрализованного, прибавляют 5 мл
раствора серебра нитрата PI; образуется желтый
осадок, цвет которого не изменяется при кипячении и
который растворяется при прибавлении раствора
аммиака Р.
Ы К 1 мл раствора, указанного в частной статье,
прибавляют 2 мл молибденованадиевого реактива P
и перемешивают; появляется желтое окрашивание.
ХЛОРИДЫ
a) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 2 мг хлорид-иона (Cl), растворяют в 2 мл воды
Р. Полученный раствор или 2 мл раствора, указанного
в частной статье, подкисляют кислотой азотной
разведенной Р, прибавляют 0.4 мл раствора серебра
нитрата Pl1 перемешивают и отстаивают; образуется
белый творожистый осадок, который центрифугируют
и промывают тремя порциями воды P по
1 мл каждая. Эту операцию проводят быстро в защищенном
от яркого света месте, при этом допускается,
чтобы жидкость над осадком не была полностью прозрачной.
Осадок суспендируют в 2 мл воды Pw прибавляют
1.5 мл раствора аммиака Р; осадок быстро
растворяется; допускается наличие нескольких крупных
частиц, растворяющихся медленно.
b) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 15 мг хлорид-иона (Cl '), или количество, указанное
в частной статье, помещают в пробирку, прибавляют
0.2 г калия дихромата P и 1 мл кислоты серной
Р. У входного отверстия пробирки помещают
фильтровальную бумагу, пропитанную 0.1 мл раствора
дифенилкарбазида P (при этом пропитанная бумага
не должна соприкасаться с калия бихроматом); бумага
окрашивается в фиолетово-красный цвет.
ЦИНК
а) 0.1 г испытуемой субстанции растворяют в 5 мл
воды Р. К полученному раствору или к 5 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 02 мл
раствора натрия гидроксида концентрированного P1
образуется белый осадок. Затем прибавляют еще 2 мл
раствора натрия гидрооксида концентрированного Р;
осадок растворяется. К полученному раствору прибавляют
10 мл раствора аммония хлорида P1 раствор
остается прозрачным. К раствору прибавляют 0.1 мл
раствора натрия сульфида Р; образуется белый хлопьевидный
осадок.
b) К 2 мл раствора, содержащего испытуемую субстанцию
в количестве, эквивалентном 5-20 мг цинк-
иона (Zn2 +), прибавляют 0.5 мл раствора калия фер-
роцианида Р; образуется белый осадок, нерастворимый
в кислоте хлороводородной разбавленной Р.
ЦИТРАТЫ
а) Навеску испытуемой субстанции, эквивалентную
около 50 мг кислоты лимонной, растворяют в 5 мл
воды Р. К полученному раствору или к 5 мл раствора,
указанного в частной статье, прибавляют 0.5 мл
кислоты серной P и 1 мл раствора калия перманга-
ната Р. Раствор нагревают до обесцвечивания, прибавляют
0.5 мл раствора 100 г/л натрия нитропрус-
сида P в кислоте серной разбавленной Р, 4 г кислоты
сульфаминовой Р. К смеси прибавляют раствор аммиака
концентрированный P до щелочной реакции
среды, прибавляя его по каплям до полного растворения
кислоты сульфаминовой. Прибавление избытка
раствора аммиака концентрированного P приводит к
появлению фиолетового окрашивания, переходящего
в фиолетово-синее.
b) К 1 мл нейтрального раствора, содержащего испытуемую
субстанцию в количестве, эквиволентном
2-10 мг цитрат-иона, прибавляют 1 мл раствора
200 г/л кальция хлорида P1 раствор остается прозрачным;
при кипячении раствора образуется белый
осадок, растворимый в кислоте хлороводородной разбавленной
Р.
с) К количеству субстанции, эквивалентному 1-2 мг
цитрат-иона, прибавляют 0.5 мл ангидрида уксусного
P и нагревают; через 20-40 с появляется красное
окрашивание.
ЭФИРЫ СЛОЖНЫЕ
К около 30 мг или к указанному в частной статье
количеству испытуемой субстанции прибавляют 0.5 мл
раствора 70 г/л гидроксиламина гидрохлорида P в
метаноле Р, 0.5 мл раствора 100 г/л калия гидроксида
P в спирте Р, нагревают при взбалтывании и
охлаждают. Полученный раствор подкисляют кислотой
хлороводородной разбавленной P1 прибавляют
0.2 мл раствора железа(Ш) хлорида PJ, разбавленного
в 10 раз; появляется синевато-красное или красное
окрашивание.
2.3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЖИРНЫХ
МАСЕЛ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
Определение проводят методом тонкослойной хроматографии
(2.2.271 используя в качестве тонкого слоя
октадецилсилильный силикагель для высокоэффективной
тонкослойной хроматографии.
Испытуемый раствор. При отсутствии других указаний
в частной статье, около 20 мг (каплю) жирного
масла растворяют в 3 мл метиленхлорида Р.
Раствор сравнения. Около 20 мг (каплю) масла кукурузного
P растворяют в 3 мл метиленхлорида Р.
На линию старта хроматографической пластинки отдельно
наносят по 1 мкл испытуемого раствора и
раствора сравнения. Пластинку дважды хроматографируют
на расстояние 0.5 см, используя в качестве
подвижной фазы эфир Р, и дважды хроматографируют
на расстояние 8 см, используя в качестве подвижной
фазы систему растворителей: метиленхлорид P -
кислота уксусная ледяная P - ацетон P (20:40:50). Затем
пластинку сушат на воздухе, опрыскивают раствором
100 г/л кислоты фосфорномолибденовой P в спирте
Р, нагревают при температуре 120 0C в течение
3 мин и просматривают при дневном освещении.
Типичная хроматограмма для идентификации жирных
масел приведена на рис. 2.3.2.-1.
I G «WF
E
D I
5 6 7 8 9 10
Рис. 2.3.2.-1 — Типичная хроматограмма для идентификации жирных масел
1 - Арахисовое масло; 2 - Оливковое масло; 3 - Кунжутное масло; 4 - Кукурузное масло; 5 - Миндальное
масло; 6 - Соевое масло; 7 - Подсолнечное масло; 8 - Рапсовое масло, 9 - Рапсовое масло (не содержащее
эруковой кислоты); 10 — Масло зародышей пшеницы
2.3.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ
ФЕНОТИАЗИНОВ МЕТОДОМ
ТОНКОСЛОЙНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
Определение проводят методом тонкослойной хроматографии
(2.2.27), используя в качестве тонкого слоя
кизельгур G Р.
Пластинку импрегнируют, помещая в закрытую камеру,
с необходимым количеством импрегнирующей смеси,
содержащей 10 % (об/об) феноксиэтанола P в
растворе 50 г/л полиэтиленгликоля 300 PB ацетоне
Р, таким образом, чтобы она была погружена в имп-
регнирующую смесь примерно на 5 мм. Когда фронт
растворителей пройдет 17 см от нижнего края пластинки,
ее вынимают из камеры и тотчас используют
для хроматографирования. Хроматографирование
проводят в том. же направлении, что и импрегнирова-
ние.
Испытуемый раствор. 20 мг испытуемой субстанции
растворяют в хлороформе P и доводят до 10 мл тем
же растворителем.
Раствор сравнения. 20 мг соответствующего фармакопейного
стандартного образца (СО ГФ PK) растворяют
в хлороформе P и доводят тем же растворителем,
до 10 мл.
На линию старта хроматографической пластинки отдельно
наносят по 2 мкл испытуемого раствора и раствора
сравнения. Пластинку помещают в камеру с
системой растворителей петролейный эфир P - я и э .
типамин P (50:1), насыщенной феноксиэтанолом P
(т.е., от 3 мл до 4 мл феноксиэтанола P прибавляют
к вышеуказанной системе растворителей, взбалтывают
до образования устойчивой мутности, декантируют
и используют верхний слой, который может быть
мутным). Хроматографирование проводят в темном
месте. Когда фронт растворителей пройдет 15 см от
линии старта, пластинку вынимают из камеры, помещают
в УФ-свет с длиной волны 365 нм и через несколько
минут проводят оценку хроматограммы.
На хроматограмме испытуемого раствора должно
обнаруживаться пятно на уровне пятна на хроматограмме
раствора сравнения, соответствующее ему по
цвету флюоресценции и величине. Затем пластинку
опрыскивают раствором 10 % (об/об) кислоты серной
P в спирте Р. На хроматограмме испытуемого
раствора должно обнаруживаться пятно на уровне
пятна на хроматограмме раствора сравнения, соответствующее
ему по окраске и ее стабильности в течение
не менее 20 мин.
2.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАПАХА
От 0.5 г до 2.0 г испытуемой субстанции распределяют
тонким слоем на часовом стекле диаметром от
6 см до 8 см; через 15 мин определяют запах или
делают вывод о его отсутствии.
2.4. ИСПЫТАНИЯ НА
ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ
ПРИМЕСЕЙ
2.4.1. АММОНИЯ СОЛИ
Метод А применяют при отсутствии других указаний в
частной статье.
МЕТОД-А
Количество испытуемого вещества, указанное в частной
статье, помещают в пробирку, растворяют в 14 мл
воды P1 при необходимости подщелачивают раствором
натрия гидроксида разбавленным P и доводят
объем раствора водой P до 15 мл. Прибавляют 0.3 мл
раствора калия тетрайод\\еркурата щелочного Р.
В качестве раствора сравнения используют раствор,
полученный прибавлением к 10 мл стандартного раствора
аммония (J млн' NHJ) Р, 5 мл воды P и
0.3 мл раствора калия тетрайодмеркурата щелочного
Р. Пробирки закрывают.
Через 5 мин желтая окраска испытуемого раствора
должна быть не интенсивнее окраски раствора сравнения.
МЕТОД В
Количество тщательно растертого испытуемого вещества,
указанное в частной статье, помещают в сосуд
вместимостью 25 мл, снабженный полиэтиленовой
пробкой, и растворяют или суспендируют в 1 мл воды
Р. Прибавляют 0.30 г магния оксида тяжелого Р,
помещают в сосуд под пробку полоску серебряно-
марганцевой бумаги Р, смоченную несколькими каплями
воды P1 таким образом, чтобы отрезок бумаги
размером 5 мм находился ниже нижнего края пробки,
после чего сосуд немедленно закрывают пробкой.
Перемешивают содержимое сосуда круговыми движениями,
не допуская попадания брызг на бумагу, и
выдерживают в водяном термостате при температуре
40 0C в течение 30 мин.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения.
К указанному в частной статье количеству стандартного
раствора аммония (J млн'1 NH *) /-'прибавляют
1 мл воды Р, 0.30 г магния оксида тяжелого /°и
далее поступают, как с испытуемым раствором.
Серая окраска серебряно-марганцевой бумаги Р,
полученная в опыте с испытуемым раствором, должна
быть не интенсивнее окраски серебряно-марганцевой
бумаги P1 полученной в опыте с раствором сравнения.
2.4.2. МЫШЬЯК
МЕТОД А
Прибор (см. Рис. 2.4.2.-1) состоит из конической колбы
вместимостью 100 мл, закрытой стеклянной притертой
пробкой, через которую проходит стеклянная
трубка длиной около 200 мм, с внутренним диадлет-
ром 5 мм. Нижняя часть трубки вытянута до внутреннего
диаметра 1.0 мм; на расстоянии 15 мм от кончика
трубки расположено боковое отверстие диаметром
от 2 мм до 3 мм. Трубка помещена таким образом,
чтобы боковое отверстие находилось диинимум
на 3 мм ниже нижней поверхности пробки. Верхний
конец трубки должен иметь совершенно плоскую притертую
поверхность, расположенную под прямым углом
к оси трубки. Другая стеклянная трубка длиной
30 мм с таким же внутренним диаметром и такой же
плоской притертой поверхностью помещается сверху
первой и плотно прикрепляется к ней двумя пружинами.
Нижнюю трубку неплотно заполняют 50-60 мг свин-
цово-ацетатной ваты P или помещают небольшой
ватный тампон и скрученную в трубочку полоску свин-
цово-ацетатной бумаги P1 массой 50-60 мг. Между
плоскими поверхностями трубок помещают кусочек
ртутно-бромидной бумаги P такого размера, чтобы
закрыть отверстие трубки (15 . 15) мм.
Указанное количество испытуемого вещества помещают
в коническую колбу и растворяют в 25 мл воды
P или указанный объем испытуемого раствора
помещают в коническую колбу; доводят объем раствора
водой P до 25 мл. Прибавляют 15 мл кислоты
хлороводородной Р, 0.1 мл раствора олова(И) хлорида
Р, 5 мл раствора калия йодида Р, оставляют на
15 мин и затем прибавляют 5 г цинка активированного
Р. Немедленно соединяют две части прибора,
колбу помещают в водяную баню, температура которой
поддерживается такой, чтобы обеспечить равномерное
выделение газа.
Параллельно в этих же условиях проводят опыт с раствором
сравнения, состоящим из 1 мл стандартного
раствора мышьяка (J млн' As3*) P и 24 мл воды Р.
По истечении не менее 2 ч окраска ртутно-бромидной
бумаги, полученная в опыте с испытуемым раствором,
должна быть не интенсивнее окраски ртутно-
бромидной бумаги, полученной в опыте с раствором
сравнения.
МЕТОД В
Количество испытуемого вещества, указанное в частной
статье, помещают в пробирку, содержащую 4 мл
кислоты хлороводородной P и около 5 мг калия йо-
дида Р, и прибавляют 3 мл реактива гипофосфита Р.
Смесь нагревают на водяной бане в течение 15 мин,
время от времени встряхивая.
Рис. 2.4.2.-1. Прибор для испытания на мышьяк
(метод А)
Размеры указаны в миллиметрах.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя вместо испытуемого вещества 0.5 мл
стандартного раствора мышьяка (JO млн '' As3+J Р.
После нагревания на водяной бане окраска испытуемого
раствора должна быть не интенсивнее окраски
раствора сравнения.
2.4.3. КАЛЬЦИЙ
При приготовлении всех растворов, применяемых в
данном испытании, должна использоваться вода дистиллированная
Р.
К 0.2 мл стандартного раствора кальция спиртового
(WO млн'1 Ca2+) P прибавляют 1 мл раствора аммония
оксалата Р. Через 1 мин прибавляют смесь 1 мл
кислоты уксусной разбавленной P и 15 мл раствора,
содержащего указанное в частной статье количество
испытуемого вещества, и встряхивают.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя смесь 1 мл кислоты уксусной разбавленной
Р, 10 мл стандартного раствора кальция
водного (JO млн' Ca2+) P и 5 мл воды дистиллированной
Р.
Через 15 мин опалесценция испытуемого раствора
не должна превышать опалесценцию раствора сравнения.
2.4.4. ХЛОРИДЫ
К 15 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют
1 мл кислоты азотной разбавленной P и
выливают смесь в один прием в пробирку, содержащую
1 мл раствора серебра нитрата Р2.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя 10 мл стандартного раствора хлорида
(5млн "' Cl') P и 5 мл воды Р. Пробирки помещают
в защищенное от света место.
Через 5 мин пробирки просматривают на черном
фоне горизонтально (перпендикулярно оси пробирок).
Опалесценция испытуемого раствора не должна превышать
опалесценцию суспензии сравнения.
2.4.5. ФТОРИДЫ
Количество испытуемого вещества, указанное в частной
статье, 0.1 г песка Р, промытого кислотой, и 20 мл
смеси равных объемов кислоты серной P и воды P
помещают во внутреннюю пробирку прибора, изображенного
на рис. 2.4.5.-1. Рубашку, заполненную
тетрахлорэтаном P1 нагревают до температуры кипения
тетрахлорэтана (146 °С). Подсоединяют генератор
водяного пара и отгоняют содержимое пробирки
с перегретым водяным паром, собирая отгон в мерную
колбу вместимостью 100 мл, содержащую 0.3 мл
0.1 M раствора натрия гидроксида и 0.1 мл раствора
фенолфталеина Р. Объем раствора в пробирке
во время отгонки должен быть постоянным (20 мл).
Поддерживают щелочную реакцию содержимого мерной
колбы, при необходимости прибавляя по каплям
0.JM раствор натрия гидроксида. Доводят объем
раствора водой P до метки и перемешивают (испытуемый
раствор).
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя вместо испытуемого вещества 5 мл
стандартного раствора фторида (JO млн ' F) Р.
В цилиндр со стеклянной притертой пробкой поме-
щают 20 мл испытуемого раствора, в другой такой
же цилиндр - 20 мл раствора сравнения, затем в
каждый цилиндр прибавляют по 5 мл реактива ами-
нометилализариндиуксусной кислоты Р.
Через 20 мин синяя окраска испытуемого раствора,
появившаяся вместо первоначальной красной, должна
быть не интенсивнее окраски раствора сравнения.
ронку, встряхивают в течение 1 мин с двумя порциями,
по 5 мл каждая, раствора 1 г/л гидроксихиноли-
но P в хлороформе Р, оставляют до расслоения и
отбрасывают органический слой. К водному слою
прибавляют 0.4 мл бутиламина / 5 M 0.1 мл триэтано-
ламина Р. Определяют рН раствора и при необходимости
доводят до рН 10.5-1 1.5. Прибавляют 4 мл
раствора 1 г/л гидроксихинолина P в хлороформе
P1 встряхивают в течение 1 мин, оставляют до расслоения,
нижний слой отбирают и используют для испытания.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя вместо 10 мл раствора испытуемого
вещества смесь 1 мл стандартного раствора магния
(10 млн' Mg2+) P и 9 мл воды Р.
Окраска испытуемого раствора должна быть не интенсивнее
окраски раствора сравнения.
2.4.7. МАГНИЙ И
ЩЕЛОЧНОЗЕМЕЛЬНЫЕ МЕТАЛЛЫ
К 200 мл воды P прибавляют 0.1 г гидроксиламина
гидрохлорида P1 10 мл амиачного буферного раствора
с рН 10.0 ., 1 мл 0.1 M раствора цинка сульфата
и около 15 мг индикаторной смеси протравного
черного IIP. Нагревают до температуры около
40 °С. Полученный раствор титруют 0.01 M раствором
натрия эдетата до перехода окраски раствора
от фиолетовой к синей. К полученному раствору прибавляют
указанное в частной статье количество испытуемого
вещества, растворенное в 100 мл воды P1
или используют указанный в частной статье раствор.
Если окраска раствора становится фиолетовой, снова
титруют до перехода окраски раствора к синей.
Объем 0.01 M раствора натрия эдетата, израсходованный
на второе титрование, не должен превышать
объем титранта, указанный в частной статье.
2.4.8. ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ
Рисунок 2.4.5.-1. Прибор для испытания на фториды
Размеры указаны в милиметрох
2.4.6. МАГНИЙ
К 10 мл раствора испытуемого вещества, приготовленного
в соответствии с указаниями в частной статье,
прибавляют 0.1 г динатрия тетрабората Р. Определяют
рН раствора и при необходимости доводят
до рН 8.8-9.2, используя кислоту хлороводородную
разбавленную P или раствор натрия гидроксида разбавленный
Р. Раствор помещают в делительную во-
B методах, приведенных ниже используют тиоацета-
мидный реактив Р. В качестве альтернативы применяют
раствор натрия сульфида Pl (0.1 мл). При использовании
раствора натрия сульфида Pl вместо тиоа-
цетамидного реактива Р, в методах А и В необходимо
включить приготовление контрольного раствора. Контрольный
раствор готовят из количества испытуемого
вещества, указанного в частной статье для приготовления
испытуемого раствора, к которому прибавляют
стандартный раствор свинца в объеме, указанном для
приготовления раствора сравнения. Испытание считается
достоверным, если контрольный раствор сопоставим
с раствором сравнения.
МЕТОД А
Испытуемый раствор. 12 мл водного раствора испытуемого
вещества, указанного в частной статье.
Раствор сравнения. Смесь 10 мл стандартного раствора
свинца (1 млн' Pb2*) Pили стандартного раствора
свинца (2 млн' Pb2+) Р, указанного в частной
статье, и 2 мл испытуемого раствора.
Компенсационный раствор. Смесь 10 мл воды P и 2
мл испытуемого раствора.
К каждому из растворов прибавляют 2 мл буферного
раствора с рН 3.5 Р, перемешивают, прибавляют
1.2 мл тиоацетамидного реактива P и немедленно
перемешивают. Растворы просматривают через 2 мин.
Испытание считается пригодным, если в сравнении с
компенсационным раствором раствор сравнения имеет
светло-коричневую окраску. Испытуемое вещество
считается пригодным, если коричневая окраска испытуемого
раствора не интенсивнее окраски раствора
сравнения.
Если оценка окраски растворов вызывает затруднения,
необходимо профильтровать растворы через
мембранный фильтр с размером пор 3 мкм (см. Рис.
2.4.8.-1, без предфильтра). Давление поршня шприца
должно быть умеренным и постоянным для обеспечения
медленного и равномерного фильтрования. Сравнивают
пятна на фильтрах, полученных при фильтровании
испытуемого раствора и растворо сравнения.
МЕТОД В
Испытуемый раствор. 12 мл раствора испытуемого
вещества, указанного в частной статье, приготовленного
путем его растворения в органическом растворителе,
содержащем минимальное количество воды
(например, диоксан или ацетон с прибавлением 15 %
воды).
Раствор сравнения. Смесь 10 мл стандартного раствора
свинца (1 или 2 млн"' Pb2+), в соответствии с
указаниями в частной статье, и 2 мл испытуемого раствора.
Стандартный раствор свинца (1 или
2 млн'1 Pb2+) готовят путем разведения стандартного
раствора свинца (WO млн1 Pb2+) P растворителем,
применяемым для растворения испытуемого вещества.
Компенсационный раствор. Смесь 10 мл растворителя,
применяемого для растворения испытуемого вещества,
и 2 мл испытуемого раствора.
К каждому из растворов прибавляют 2 мл буферного
раствора с рН 3.5 P1 перемешивают, прибавляют
1.2 мл тиоацетамидного реактива P и немедленно
перемешивают. Растворы просматривают через 2 мин.
Испытание считается пригодным, если в сравнении с
компенсационным раствором раствор сравнения имеет
светло-коричневую окраску. Испытуемое вещество
считается пригодным, если коричневая окраска испытуемого
раствора не интенсивнее окраски раствора
сравнения.
Если оценка окраски растворов вызывает затруднения,
необходимо профильтровать растворы через
мембранный фильтр с размером пор 3 мкм (см. Рис
2.4.8.-1, без предфильтра). Давление поршня шприца
должно быть умеренным и постоянным для обеспечения
медленного и равномерного фильтрования. Сравнивают
пятна на фильтрах, полученных при фильтровании
испытуемого раствора и раствора сравнения.
МЕТОД С
Испытуемый раствор. В кварцевый тигель помещают
4 мл раствора 250 г/л магния сульфата P в кислоте
серной разбавленной P и прибавляют количество
испытуемого вещества, указанное в частной статье
(не более 2 г). Перемешивают тонкой стеклянной
палочкой и осторожно нагревают. Если смесь жидкая,
осторожно выпаривают на водяной бане до сухого
остатка, затем постепенно нагревают до обугливания
и продолжают нагревание до получения почти
белого или в крайнем случае сероватого остатка.
Сжигание проводят при температуре не более 800 0C
Оставляют до охлаждения, затем остаток в тигле смачивают
несколькими каплями кислоты серной разбавленной
Р. Выпаривают до сухого остатка, вновь сжигают
и оставляют до охлаждения. Общее время сжигания
не должно превышать 2 ч. Остаток из тигля
количественно переносят в пробирку двумя порциями
кислоты хлороводородной разбавленной Р, по 5 мл
каждая. Прибавляют 0.1 мл раствора фенолфталеина
P1 затем подщелачивают раствором аммиака концентрированным
P до появления розовой окраски.
Охлаждают, прибавляют кислоту уксусную ледяную P
до обесцвечивания раствора и прибавляют еще 0.5 мл
кислоты уксусной ледяной Р. При необходимости фильтруют
и промывают фильтр водой Р. Доводят объем
раствора водой PRO 20 мл и перемешивают.
Раствор сравнения. Параллельно, в этих же условиях,
готовят раствор сравнения, используя вместо испытуемого
вещества указанный объем стандартного раствора
свинца (W млн "' РЫ+) Р. К 10 мл полученного
раствора прибавляют 2 мл испытуемого раствора.
Контрольный раствор. Параллельно в этих же условиях
готовят контрольный раствор, прибавляя к испытуемому
веществу стандартный раствор свинца (10 млн
Pb2+) P в объеме, указанном для приготовления раствора
сравнения. К 10 мл полученного раствора прибавляют
2 мл испытуемого раствора.
Компенсационный раствор. Смесь 10 мл воды Pw
2 мл испытуемого раствора.
К 12 мл каждого из растворов прибавляют 2 мл буферного
раствора с рН 3.5 P1 перемешивают, прибавляют
1.2 мл тиоацетамидного реактива P'и немедленно
перемешивают. Растворы просматривают через
2 мин. Испытание считается пригодным, если в
сравнении с компенсационным раствором раствор
сравнения имеет светло-коричневую окраску или контрольный
раствор сопоставим с раствором сравнения.
Испытуемое вещество считается пригодным, если
коричневая окраска испытуемого раствора не интенсивнее
окраски раствора сравнения.
Если оценка окраски растворов вызывает затруднения,
необходимо профильтровать растворы через
мембранный фильтр с размером пор 3 мкм (см. Рис.
2.4.8.-1, без предфильтра). Давление поршня шприца
должно быть умеренным и постоянным для обеспечения
медленного и равномерного фильтрования. Сравнивают
пятна на фильтрах, полученных при фильтровании
испытуемого раствора и раствора сравнения.
МЕТОД D
Испытуемый раствор. Количество испытуемого вещества,
указанное в частной статье, помещают в кварцевый
тигель и тщательно смешивают с 0.5 г магния
оксида Pl. Сжигают при слабом красном калении до
образования однородного остатка белого или серовато-
белого цвета. Если после 30 мин сжигания смесь
остается окрашенной, тигель оставляют до охлаждения,
содержимое перемешивают тонкой стеклянной
палочкой и повторяют сжигание. При необходимости
операцию повторяют. Нагревают при температуре
800 0C около 1 ч. Остаток из тигля количественно
переносят в пробирку двумя порциями по 5 мл смеси
равных объемов кислоты хлороводородной Pl и воды
Р. Прибавляют 0.1 мл раствора фенолфталеина
Р, затем подщелачивают раствором аммиака концентрированного
P до появления розовой окраски. Охлаждают,
подкисляют кислотой уксусной ледяной P
до обесцвечивания раствора и прибавляют еще 0.5 мл
кислоты уксусной ледяной Р. При необходимости фильтруют
и промывают фильтр. Доводят объем раствора
водой PRO 20 мл и перемешивают.
Раствор сравнения. Параллельно, в этих же условиях,
готовят раствор сравнения, используя вместо испытуемого
вещества указанный объем стандартного раствора
свинца ( 1 0 млн "' Pb2+) P и высушивают в сушильном
шкафу при температуре 100-105 °С. К
10 мл полученного раствора прибавляют 2 мл испытуемого
раствора.
Контрольный раствор. Параллельно, в этих же условиях,
готовят контрольный раствор, прибавляя к испытуемому
веществу стандартный раствор свинца
(Wмлн "' Pb2+) PB объеме, указанном для приготовления
раствора сравнения и высушивая в сушильном
шкафу при температуре 100-105 0 C К 10 мл полу-
Рисунок. 2.4.8.-1. Прибор для испытания на соли тяжелых металлов
Размеры указаны в миллиметрах
ценного раствора прибавляют 2 мл испытуемого раствора.
Компенсационный раствор. Смесь 10 мл воды P и
2 мл испытуемого раствора.
К 12 мл каждого из растворов прибавляют 2 мл буферного
раствора с рН 3.5 P1 перемешивают, прибавляют
1.2 мл тиоацетамидного реактива P и немедленно
перемешивают. Растворы просматривают через
2 мин. Испытание считается пригодным, если в
сравнении с компенсационным раствором раствор
сравнения имеет светло-коричневую окраску или контрольный
раствор сопоставим с раствором сравнения.
Испытуемое вещество считается пригодным, если
коричневая окраска испытуемого раствора не интенсивнее
окраски раствора сравнения.
Если оценка окраски растворов вызывает затруднения,
необходимо профильтровать растворы через
мембранный фильтр с размером пор 3 мкм (см. Рис.
2.4.8.-1, без предфильтра). Давление поршня шприца
должно быть умеренным и постоянным для обеспечения
медленного и равномерного фильтрования. Сравнивают
пятна на фильтрах, полученных при фильтровании
испытуемого раствора и раствора сравнения.
МЕТОД E
Испытуемый раствор. Количество испытуемого вещества,
указанное в частной статье, растворяют в 30 мл
или в указанном в частной статье объеме воды Р.
Раствор сравнения. Готовят путем разведения стандартного
раствора свинца (1 млн'1 Pb2+J P до объема,
указанного для испытуемого раствора, при отсутствии
других указаний в частной статье.
В держатель устройства для стерильного фильтрования,
на подложку которого помещен мембранный
фильтр (размер пор - 3 мкм), а сверху него - предфильтр
(Рис. 2.4.8.-1), устанавливают шприц вместимостью
50 мл без поршня.
Испытуемый раствор помещают в шприц и вводят
поршень, развивая такое давление, чтобы профильтровался
весь раствор. Открывают держатель и вынимают
предфильтр таким образом, чтобы мембранный
фильтр не загрязнился примесями. В противном случае
его заменяют другим мембранным фильтром и
операцию повторяют в тех же условиях.
К фильтрату или к указанному в частной статье объему
фильтрата прибавляют 2 мл буферного раствора
с рН 3.5 P и перемешивают. Полученную смесь прибавляют
к 1.2 мл реактива тиоацетамидо P и перемешивают,
оставляют на 10 мин и вновь фильтруют,
как описано выше, но расположение фильтров изменяют
таким образом, чтобы жидкость проходила вначале
через мембранный фильтр, а затем - через предфильтр
(Рис 2.4.8.-1). Давление поршня шприца должно
быть умеренным и постоянным для обеспечения
медленного и равномерного фильтрования. После
окончания фильтрования держатель открывают, мембранный
фильтр вынимают и высушивают при помощи
фильтровальной бумаги.
Параллельно в условиях, описанных для испытуемого
раствора, обрабатывают раствор сравнения.
Окраска пятна, полученная в опыте с испытуемым
раствором, должна быть не интенсивнее окраски пятна,
полученной в опыте с раствором сравнения.
МЕТОД F
Испытуемый раствор. Количество испытуемого вещества,
указанное в частной статье, помещают в чистую,
сухую колбу Кьельдаля вместимостью. 100 мл (в
случае интенсивного пенообразования следует применить
колбу вместимостью 300 мл). Колбу закрепляют
под углом 45 0 и прибавляют смесь 8 мл кислоты
серной P и 10 мл кислоты азотной P в количестве,
достаточном для полного смачивания испытуемого
вещества (в случае, если испытуемое вещество представляет
собой твердое вещество) или несколько миллилитров
вышеуказанной смеси (в случае, если испытуемое
вещество представляет собой жидкость). Осторожно
нагревают до начала реакции, затем дают
реакции стихнуть и прибавляют дополнительные порции
этой же смеси кислот, нагревая после каждого
прибавления. Операцию повторяют до тех пор, пока
объем прибавленной смеси кислот не достигнет 18 мл.
Усиливают нагрев и осторожно кипятят до потемнения
раствора. Охлаждают, прибавляют 2 мл кислоты
азотной P и вновь нагревают до потемнения раствора.
Продолжают прибавление кислоты азотной Pc
последующим нагреванием до тех пор, пока раствор
не перестанет темнеть, затем сильно нагревают до
появления плотных белых паров. Охлаждают, осторожно
прибавляют 5 мл воды Р, кипятят с предосторожностями
до появления плотных белых паров и продолжают
нагревание до получения остатка объемом
2-3 мл. Охлаждают, осторожно прибавляют 5 мл
воды P и определяют окраску раствора. Если раствор
имеет желтую окраску, осторожно прибавляют по каплям
1 мл раствора водорода пероксида концентрированного
P и вновь нагревают до появления плотных
белых паров и продолжают нагревание до получения
остатка объемом 2-3 мл. Если окраска раствора
все еще остается желтой, повторяют прибавление
5 мл воды P и 1 мл раствора водорода пероксида
концентрированного Pдо обесцвечивания раствора.
Охлаждают, осторожно доводят объем раствора водой
P до 25 мл.
Доводят рН раствора до 3.0-4.0 раствором аммиака
концентрированным Pl (при приближении к указан-
ному значению рН можно применять раствор аммиака
разбавленного Pl)1 используя в качестве внешнего
индикатора индикаторную бумагу, действующую в
узком интервале рН, затем доводят объем раствора
водой P до 40 мл, перемешивают и прибавляют 2 мл
буферного раствора рН 3.5 Р. Полученную смесь
прибавляют к 1.2 мл тиоацетамидного реактива Pw
немедленно перемешивают. Доводят объем раствора
водой P до 50 мл и перемешивают.
Раствор сравнения. Параллельно в этих же условиях
готовят раствор сравнения, используя вместо испытуемого
вещества указанный в частной статье объем
стандартного раствора свинца (10 млн' Pb2+) Р.
Контрольный раствор. Параллельно в этих же условиях
готовят контрольный раствор, прибавляя к испытуемому
веществу стандартный раствор свинца (10 млн ''
Pb2*) P в объеме, указанном для приготовления раствора
сравнения.
Компенсационный раствор. Готовят в условиях, описанных
для приготовления испытуемого раствора, без
использования испытуемого вещества.
Сравнение растворов производят на белом фоне.
Через 2 мин коричневая окраска испытуемого раствора
должна быть не интенсивнее окраски раствора
сравнения.
Испытание считается пригодным, если в сравнении с
компенсационным раствором раствор сравнения имеет
коричневую окраску или контрольный раствор сопоставим
с раствором сравнения.
Если оценка окроски растворов вызывает затруднения,
необходимо профильтровать растворы через
мембранный фильтр с размером пор 3 мкм (см. Рис.
2.4.8.-1, без предфильтра). Давление поршня шприца
должно быть умеренным и постоянным для обеспечения
медленного и равномерного фильтрования. Сравнивают
пятна на фильтрах, полученных при фильтровании
испытуемого раствора и раствора сравнения.
МЕТОД G
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При использовании реакционных
сосудов, находящихся под высоким давлением,
необходимо соблюдать меры предосторожности и
инструкции по эксплуатации, данные производителем.
Цикл процесса должен быть детально разработан в
зависимости от типа используемой микроволновой
печи (например, микроволновые печи, контролирующие
энергию, микроволновые печи, контролирующие
температуру или печи с высоким давлением). Цикл
должен соответствовать требованиям инструкции производителя.
Цикл процесса считается пригодным при
получении прозрачного раствора.
Испытуемый раствор. Количество испытуемого вещества,
указанное в частной статье (не более 0.5 г),
помещают в соответствующий чистый химический стакан.
Последовательно прибавляют 2.7 мл кислоты
серной P1 3.3 мл кислоты азотной P1 2.0 мл раствора
пероксида водорода концентрированного P и каждый
раз после прибавления очередного реагента перемешивают
с помощью магнитной мешалки. Полученную
смесь переносят в сухой реакционный сосуд,
устойчивый к высокому давлению (фторполимер или
кварцевое стекло).
Раствор сравнения. Параллельно в этих же условиях
готовят раствор сравнения, используя вместо испытуемого
вещества указанный объем стандартного раствора
свинца (10 млн' Pb2+) Р.
Контрольный раствор. Параллельно в этих же условиях
готовят контрольный раствор, прибавляя к испытуемому
веществу стандартный раствор свинца (10 млн '
Pb2+) P в объеме, указанном для приготовления раствора
сравнения.
Компенсационный раствор. Готовят компенсационный
раствор в условиях, описанных для приготовления испытуемого
раствора, без использования испытуемого
вещества.
Сосуды закрывают крышкой и помещают в лабораторную
микроволновую печь.
Реакцию проводят, последовательно используя две отдельные
соответствующие программы. Модель программы
должна быть пригодна для того, чтобы на отдельных
этапах контролировать ход реакции, давление, температуру
или энергию, зависящие от типа микроволновой
печи. После первой программы реакционные сосуды
охлаждают, снимают крышки. В каждый сосуд
прибавляют 2.0 мл раствора пероксида водорода концентрированного
P и продолжают процесс, используя
вторую программу. После второй программы реакционные
сосуды охлаждают, затем снимают крышки. При
необходимости получения прозрачного раствора, процедуру
прибавления раствора пероксида водорода
концентрированного P повторяют и продолжают процесс,
используя вторую программу.
Колбу охлаждают и осторожно ополаскивают водой
Р. Общий объем не должен превышать 25 мл. рН
полученного раствора доводят до 3.0 - 4.0 раствором
аммиака концентрированного Pl (при приближении
к указанному значению рН можно применять раствор
аммиака разбавленного Pl) используя индикаторную
бумагу с узким интервалом рН. Избегая нагревания
раствора, используют ледяную баню и магнитную
мешалку. Доводят до объема 40 мл водой P и
перемешивают. Прибавляют 2 мл буферного раствора
с рН 3.5 ., 1.2 мл тиоацетамидного реактива P и
немедленно перемешивают. Доводят до объема
50 мл водой P1 перемешивают и оставляют на 2 мин.
Растворы фильтруют через мембранный фильтр с
размером пор 3 мкм (см. Рис. 2.4.8.-1, без предфильтра).
Давление поршня шприца должно быть умеренным
и постоянным для обеспечения медленного и равномерного
фильтрования. Сравнивают пятна на фильтрах,
полученных при фильтровании растворов,
Определяют пятна на фильтрах. Коричневая окраска
пятна, полученного при фильтровании испытуемого
раствора, не должна быть интенсивнее окраски пятна
раствора сравнения.
Тест считается пригодным, если в сравнении с пятном
компенсационного раствора пятно раствора сравнения
имеет коричневую окраску, или пятно контрольного
раствора сопоставимо с пятном раствора сравнения.
2.4.9. ЖЕЛЕЗО
Количество испытуемого вещества, указанное в частной
статье, растворяют в воде P1 доводят объем раствора
водой P до 10 мл и перемешивают; или используют
10 мл раствора, указанного в частной статье.
Прибавляют 2 мл раствора 200 г/л кислоты лимонной
P и 0.1 мл кислоты тиогликолевой Р. Перемешивают,
подщелачивают раствором аммиака P1
доводят объем раствора водой P до 20 мл.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя 10 мл стандартного раствора
железо////) (J млн' Fe3+) Р.
Через 5 мин розовая окраска испытуемого раствора
должна быть не интенсивнее окраски раствора сравнения.
2.4.10. СВИНЕЦ В CAXAPAX
Определение свинца проводят методом атомно-аб-
сорбционной спектрометрии [2.2.23, метод 2).
Испытуемый раствор. 20.0 г испытуемого вещества
растворяют в смеси равных объемов кислоты уксусной
разбавленной Pw воды Р, доводят объем раствора
этой же смесью растворителей до 100.0 мл и перемешивают.
Прибавляют 2.0 мл насыщенного раствора
(около 10 г/л) аммония пирролидиндитиокар-
бамата Pw 10.0 мл метилизобутилкетона Pw встряхивают
в течение 30 с в защищенном от яркого света
месте. Оставляют до расслоения. Для испытания используют
слой метилизобутилкетона.
Растворы сравнения. Готовят три раствора сравнения
аналогично испытуемому раствору, но с добавлением
к 20.0 г испытуемого вещества соответственно
0.5 мл, 1,0 мл и 1.5 мл стандартного раствора свинца
(10 млн' Pb'+) P
Устанавливают нулевую точку на приборе, используя
метилизобутилкетон P1 обработанный аналогично
испытуемому раствору, но без добавления испытуемого
вещества. Измеряют поглощение при длине волны
283.3 нм, используя в качестве источника излучения
лампу с полым свинцовым катодом и воздушно-ацетиленовое
пламя.
Испытуемое вещество должно содержать не более
0.5 млн4 свинца при отсутствии других указаний в
частной статье.
2.4.11. ФОСФАТЫ
К 100 мл приготовленного и при необходимости нейтрализованного
в соответствии с указаниями в частной
статье раствора прибавляют 4 мл сульфомолиб-
денового реактива РЗ. Встряхивают и прибавляют
0.1 мл раствора олова(И) хлорида Pl
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя вместо 100 мл раствора испытуемого
вещества смесь 2 мл стандартного раствора фосфата
(5 млн' PO3) P и 98 мл воды Р. Через 10 мин
сравнивают окраску 20 мл каждого раствора.
Окраска испытуемого раствора должно быть не интенсивнее
окраски раствора сравнения.
2.4.12. КАЛИЙ
К 10 мл раствора, приготовленного в соответствии с
указаниями в частной статье, прибавляют 2 мл свежеприготовленного
раствора 10 г/л натрия тетрафе-
нилбората Р.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя вместо 10 мл раствора испытуемого
вещества смесь 5 мл стандартного раствора калия
(20 млн' K+)Pw 5 мл воды Р.
Через 5 мин опалесценция испытуемого раствора не
должна превышать опалесценцию раствора сравнения.
2.4.13. СУЛЬФАТЫ
При приготовлении всех растворов, применяемых в
данном испытании, должна использоваться вода дистиллированная
Р.
К 4.5 мл стандартного раствора сульфата (Ю млн'
SOf') P l прибавляют 3 мл раствора 250 г/л бария
хлорида Р. Встряхивают и оставляют на 1 мин, к
2.5 мл полученного раствора прибавляют 15 мл испытуемого
раствора, приготовленного в соответствии
с указаниями в частной статье, и 0.5 мл кислоты уксусной
Р.
Параллельно в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя вместо испытуемого раствора 15 мл
стандартного раствора сульфата (10 .WIN' SO"'/ P
Через 5 мин опалесценция испытуемого раствора не
должна превышать опалесценцию раствора сравнения.
2.4.14. СУЛЬФАТНАЯ ЗОЛА
Фарфоровый, кварцевый или платиновый тигель прокаливают
при температуре 600 ± 50 0C в течение
30 мин, охлаждают в эксикаторе над силиколем и взвешивают.
Количество испытуемого вещества, указанное
в частной статье помещают в тигель, взвешивает,
смачивают небольшим количеством кислоты сер-
Шй P (обычно 1 мл), осторожно нагревают как мож-
Io при низкой температуре до полного обугливания
Испытуемого вещества и охлаждают в эксикаторе. Полученный
остаток в тигле снова смачивают небольшим
количеством кислоты серной Р, осторожно нагревают
до удаления белых паров и прокаливают
при температуре 600 ± 50 0C до полного сгорания
остатка. В продолжение всей процедуры в тигле не
должно появляться пламя. Затем тигель охлаждают .
эксикаторе над силиколем, взвешивают и вычисляют
массу остатка.
Если масса остатка превышает указанный предел,
остаток снова смачивают кислотой серной Pw повторяют
прокаливание, как описано выше, до постоянной
массы.
232.0 нм, используя в качестве источника излучения
лампу с полым никелевым катодом и воздушно-ацетиленовое
пламя.
Испытуемое вещество должно содержать не более
] млн''' никеля при отсутствии других указаний в частной
статье.
2.4.16. ОБЩАЯ ЗОЛА
Кварцевый или платиновый тигель нагревают при красном
калении в течение 30 мин, охлаждают в эксикаторе
и взвешивают. При отсутствии других указаний в
частной статье 1.00 г испытуемого вещества или измельченного
в порошок лекарственного растительного
сырья помещают в тигель и равномерно распределяют
по дну тигля. Высушивают при температуре от
100 0C до 105 0C в течение 1 ч и затем сжигают до
постоянной массы в муфельной печи при температуре
600 ± 25 °С, охлаждая тигель в эксикаторе после
каждого сжигания. В продолжение всей процедуры .
тигле не должно появляться пламя. Если после длительного
сжигания зола все еще содержит темные частицы,
содержимое тигля количественно переносят горячей
водой на беззольный фильтр и сжигают остаток на
фильтре вместе с фильтровальной бумагой. Фильтрат
объединяют с золой, осторожно выпаривают до сухого
остатка и сжигают до постоянной массы.
2.4.17. АЛЮМИНИЙ
2.4.15. НИКЕЛЬ В ПОЛ ИОЛ AX
Определение никеля проводят методом атомно-абсорбционной
спектрометрии (2.2.23, метод 2).
Испытуемый раствор. 20.0 г испытуемого вещества
растворяют в смеси равных объемов кислоты уксусной
разбавленной Pa воды Р, доводят объем раствора
этой же смесью растворителей до 100 мл и перемешивают.
Прибавляют 2.0 мл насыщенного раствора
(около 10 г/л) аммония пирролидиндитиокарба-
мата P и ] 0.0 мл метилизобутнлкетона P и встряхивают
в течение 30 с в защищенном от яркого света
месте. Оставляют до расслоения. Для испытания используют
слой метилизобутилкетона.
Растворы сравнения. Готовят три раствора сравнения
аналогично испытуемому раствору, но с добавлением
к 20.0 г испытуемого вещества соответственно
0.5 мл, 1.0 мл и 1.5 мл стандартного раствора никеля
(10 млн'1 Ni2HP
Устанавливают нулевую точку на приборе, используя
метилизобутилкетон P1 обработанный аналогично
испытуемому раствору, но без добавления испытуемого
вещества. Измеряют поглощение при длине волны
Раствор испытуемого вещества, приготовленный в
соответствии с указаниями в частной статье, помещают
в делительную воронку, встряхивают с двумя порциями,
по 20 мл каждая, раствора 5 г/л гидроксихи-
нолина P в хлороформе Р, затем с 10 мл этого же
раствора. Хлороформные слои отделяют и собирают
в мерную колбу вместимостью 50.0 мл. Доводят объем
раствора хлороформом Pдо метки и перемешивают
(испытуемый раствор).
Раствор сравнения готовят аналогично, используя указанный
в частной статье раствор.
Компенсационный раствор готовят аналогично, используя
указанный в частной статье раствор.
Измеряют интенсивность флюоресценции (2.2.21) испытуемого
раствора (Z1), раствора сравнения (/,) и
компенсационного раствора (L), используя возбуждающее
излучение при длине волны 392 нм и вторичный
фильтр с полосой пропускания, имеющей максимум
при длине волны 518 нм, или монохроматор, установленный
на пропускание этой длины волны.
Флюоресценция {/,-/.) испытуемого раствора не долЯ|
на превышать флюоресценцию раствора сравнеяш
.
2.4.18. СВОБОДНЫЙ
ФОРМАЛЬДЕГИД
Метод А применяют при отсутствии других указаний в
частной статье. Метод В пригоден для вакцин, в которых
для нейтрализации избыточного формальдегида
используют натрия метабисульфит.
МЕТОД А
Вакцины, используемые для человека, разводят в
10 раз. Бактериальные токсоиды, применяемые в ветеринарии,
разводят в 25 раз. 1 мл испытуемой вакцины,
разведенной как указано выше, помещают в
пробирку и прибавляют 4 мл воды P и 5 мл реактива
ацетилацетона Pl. Пробирку помещают в водяную
баню с температурой 40 °С на 40 мин. Параллельно
в этих же условиях готовят раствор сравнения,
используя вместо разведенной вакцины 1 мл раствора
формальдегида Р, разведенного до содержания
формальдегида (CH,О) 20 мкг/мл.
Пробирки просматривают вдоль их вертикальных осей.
Окраска испытуемого раствора должна быть не интенсивней
окраски раствора сравнения.
МЕТОД В
Испытуемый раствор. Готовят разведение 1 до 200
испытуемой вакцины в воде Р. Если испытуемая вакцина
представляет собой эмульсию, готовят эквивалентное
разведение водной фазы, отделенной одним из
нижеприведенных способов. При использовании одного
из нижеописанных способов отделения водной
фазы, далее готовят разведение 1 до 20.
Растворы сравнения. Готовят разведение раствора
формальдегида PB воде Pдо получения растворов с
концентрацией формальдегида (CH2O) 0.25 г/л,
0.50 г/л, 1.00 г/л и 2.00 г/л. Готовят разведение 1 до
200 каждого из растворов в воде Р.
В отдельные пробирки помещают по 0.5 мл испытуемого
раствора или раствора сравнения, прибавляют
5.0 мл свежеприготовленного раствора 0.5 г/л метил-
бензотиазолонгидразона гидрохлорида Р. Пробирки
закрывают, встряхивают и оставляют на 60 мин. Прибавляют
1 мл реактива железа(Ш) хлорида - сульфаминовой
кислоты P'и оставляют на 15 мин. Измеряют
оптическую плотность (2.2.25) растворов при длине
волны 628 нм. Содержание формальдегида в испытуемой
вакцине вычисляют по калибровочной кривой,
построенной с использованием растворов сравнения.
Испытание считается пригодным, если коэффициент
корреляции (г) калибровочной кривой более 0.97.
Эмульсии. Если испытуемая вакцина представляет собой
эмульсию, испытуемый раствор готовят из водной
фазы, отделенной соответствующим способод/. Ниже
представлены два способа отделения водной фазы.
(a) К 1.0 мл изопропилмиристата /-'прибавляют 1.0мл
испытуемой вакцины и перемешивают. Затем прибавляют
1.3 мл IM кислоты хлороводородной, 2.0 мл
хлороформа P и 2.7 мл раствора 9 г/л натрия хлорида
Р. Тщательно перемешивают и центрифугируют с
ускорением 15 000 об/мин в течение 60 мин. Водную
фазу сливают в мерную колбу вместимостью
10 мл и доводят объем раствора до метки водой Р.
Если описанная методика не позволяет достичь отделения
водной фазы, прибавляют 100 г/л полисорбата
20 P к раствору натрия хлорида и повторяют процедуру,
центрифугируя с ускорением 22 500 об/мин.
(b) К 1.0 мл раствора 100 г/л натрия хлорида P прибавляют
1.0 мл испытуемой вакцины и перемешивают.
Центрифугируют с ускорением 1000 об/мин в
течение 15 мин. Водную фазу сливают в мерную колбу
вместимостью 10 мл и доводят объем раствора до
метки водой Р.
(c) К 2,0 мл раствора 100 г/л натрия хлорида /-'прибавляют
1.0 мл испытуемой вакцины, 3.0 мл хлороформа
P и перемешивают. Центрифугируют с ускорением
1000 об/мин в течение 5 мин. Водную фазу
сливают в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят
объем раствора до метки водой Р.
2.4.19. ЩЕЛОЧНЫЕ ПРИМЕСИ
В ЖИРНЫХ МАСЛАХ
В пробирку помещают 10 мл свежеперегнанного ацетона
P и 0.3 мл воды Р, прибавляют 0.05 мл раствора
0.4 г/л бромфенолового синего PB спирте Р; при
необходимости раствор нейтрализуют 0.01 M кислотой
хлороводородной или 0.01 M раствором натрия
гидроксида, затем прибавляют 10 мл испытуемого
масла, встряхивают и оставляют до разделения слоев.
Для изменения окраски верхнего слоя в желтую должно
быть израсходовано не более 0.1 мл 0.01 M кислоты
хлороводородной.
2.4.20. АНТИОКСИДАНТЫ
В ЖИРНЫХ МАСЛАХ
Испытание проводят методом тонкослойной хроматографии
(2.2.27), используя пластинки, покрытые тонким
слоем силикагеля G Р. Перед применением пластинки
высушивают при температуре 130 0C в течение
2 ч.
Испытуемый раствор (а). 20 г испытуемого вещества,
взятого из центра образца, или 20 г масла помещают
в делительную воронку, прибавляют 50 мл петро-
лейного эфира P и энергично встряхивают с двумя
порциями по 30 мл метанола (75 % об/об). После
четкого разделения слоев нижние, метанольные, слои
объединяют и выпаривают при пониженном давлении
и возможно более низкой температуре в атмосфере
азота. Остаток растворяют в 5 мл хлороформа, свободного
от этанола Р. Хранят в плотно укупоренном
сосуде.
Испытуемый раствор (Ь). Слой петролейного эфира
(верхний слой), полученный при приготовлении испытуемого
раствора (а), осторожно выпаривают до сухого
остатка. Прибавляют 0.5 г пирогаллола Р, растворенного
в 100 мл этанола P1 затем 15 мл свежеприготовленного
раствора 330 г/л натрия гидроксида
P и кипятят с обратным холодильником в течение
30 мин. Охлаждают, прибавляют 250 мл воды P
и извлекают неомыляемые вещества тремя порциями
по 100 мл петролейного эфира Р. Объединенные
извлечения петролейного эфира промывают водой P
до отсутствия щелочной реакции и выпаривают до
сухого остатка. Остаток растворяют в 5 мл хлороформа,
свободного от этанола Р. Хранят в хорошо
укупоренном сосуде.
А. НЕПОЛИГИДРОКСИАНТИОКСИДАНТЫ
Пластинку помещают в хроматографическую камеру
с хлороформом, свободным от этанола, Р. Когда
фронт растворителя пройдет около 12 см от нижнего
края пластинки, пластинку вынимают из камеры,
высушивают в течение 20 мин на воздухе, затем в
течение 20 мин в эксикаторе под вакуумом.
На линию старта хроматографической пластинки,
подготовленной, как указано выше, в стартовую точку
№ 1 (см. Рис. 2.4.20.-1) наносят испытуемый раствор
(а) в виде пятна диаметром не более 5 мм.
Объем наносимого испытуемого раствора (а) зависит
от его концентрации и составляет обычно от 2 мкл
до 10 мкл. В стартовые точки №№ 2 и 3 (см. Рис.
2.4.20.-1) наносят по 2 мкл окрашенного раствора,
содержащего по 0.1 г/л диметилового желтого Р,
СУДАНА красного GPw индофенолового синего P в
бензоле Р. На пластинке отмечают длину пробега
(10 см) в двух направлениях. В первый раз пластинку
хроматографируют в камере с хлороформом, свободНЫМ
от ЭТАНОЛА Р. Пластинку высушивают на воздухе
в течение 10 мин, затем поворачивают на 90 0 и
хроматографируют в камере с бензолом Р. Пластинку
высушивают на воздухе в течение 5 мин и опрыскивают
раствором 200 г/л кислоты фосфорномолиб-
деновой P B ЭТАНОЛЕ PДО устойчивого окрашивания
пластинки в желтый цвет. Через 2 мин начинают проявляться
синие пятна. В течение первых 5-10 мин пластинку
обрабатывают парами аммиака до тех пор,
пока фон не станет чисто белым. На пластинке остаются
синие, светло-фиолетовые или зеленоватые пятна.
Хроматограмму оценивают, сравнивая с Рис. 2.4.20.-1.
Если на линии старта обнаруживаются синие пятна,
проводят разделение и идентификацию полигидрок-
сиантиоксидантов (метод В).
Первое направление
^ хроматографирования, IQ см
ь. Хлороформ
о
а I
. (..4 > о ь
ABC , I
Фронт
I
Рисунок. 2.4.20.-1. — Типичные хроматограммы
антиоксидантов (Методы А и Cj
а = Стартовая точка № 1 + пятно галлатов + пятно
нордигидрогваяретовой кислоты
ь = Стартовая точка № 2
с = Стартовая точка № 3
1 = Гваяковая смола
2 = 3-(1,1 -Диметилэтил)-4-метоксифенол
3 = 2-(1,1 -Диметилэтил)-4-метоксифенол
4 = 2,2,5,7,8-Пентаметил-б-хроманол
5 = Тетраэтилтиурам дисульфид
6 = а-Токоферол
7 = Дибутилгидроксианизол
8 = Бутил гидрокситолуол
А = желтый
В = красный
С = синий
Метод А: сплошная линия
Метод С: пунктирная линия
В. ПОЛИГИДРОКСИАНТИОКСИДАНТЫ
На линию старта хроматографической пластинки наносят
1 мкл, 2 мкл, 4 мкл и 6 мкл испытуемого раствора
(а), а также от 1 мкл до 2 мкл окрашенного
раствора, приготовленного, как указано в методе А.
Пластинку помещают в камеру с системой растворителей:
кислота уксусная ледяная P- бензол P- пет-
ролейный эфир P (30:60:60). Когда фронт растворителей
пройдет около 13 см от линии старта, пластинку
вынимают из камеры, высушивают на воздухе, опрыскивают
раствором 200 г/л кислоты фосфорномо-
либденовой P в этаноле P и продолжают проявление
по методике, описанной для идентификации не-
полигидроксиантиоксидантов.
Полигидроксиантиоксиданты идентифицируют, сравнивая
положение пятен на хроматограмме испытуемого
раствора по отношению к пятнам не хроматограмме
окрашенного раствора (см. Рис. 2.4.20.-2).
Рис. 2.4.20.- 2. — Типичные хроматограммы полигид-
роксиантиоксидантов (метод В)
1 = Окрашенный раствор
2 = Бутилированный гидроксианизол
3 = Гваяковая смола
4 = Нордигидрогваяретовая кислота
5 = Метилгаллат
6 = Этилгаллат
7 = Пропилгаллат
8 = Октилгаллат
9 = Додецилгаллат
А = желтый
В - красный
С = синий
С. АНТИОКСИДАНТЫ, НЕ ИЗВЛЕКАЕМЫЕ
МЕТАНОЛОМ
Испытание проводят методом тонкослойной хроматографии
на другой пластинке. Хроматографирование
проводят по методике, описанной для неполигид-
роксиантиоксидантов, используя вместо испытуемого
раствора (а) испытуемый раствор (Ь). Пластинку опрыскивают
раствором 10 г/л дихлорхинонхлоримидо
PB этаноле Р. Пятна проявляются в течение 15 мин.
Хроматограмму оценивают, сравнивая с Рис. 2.4.20.-1.
Зоны, отмеченные пунктиром, соответствуют а-токо-
феролу и бутилированному гидрокситолуолу. Пятна
.- и .-токоферола находятся в зоне, соответствующей
2-( 1,1 -диметилэтил)-4-метоксифенолу.
Если в испытуемом веществе в существенном количестве
присутствует бутилированный гидрокситолуол, его
определяют по методу А.
2.4.21. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСТОРОННИХ
МАСЕЛ В ЖИРНЫХ МАСЛАХ
МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
Испытание проводят методом тонкослойной хроматографии
(2.2.27) с использованием в качестве тонкого
слоя кизельгура С Р. Пластинку импрегнируют,
поместив в камеру, содержащую смесь вазелинового
масла P и петролейного эфира P (10:90) в таком количестве,
чтобы нижний край пластинки погрузился
на 5 мм ниже поверхности жидкости. Когда смесь для
импрегнирования поднимется не менее чем на 12 см
от нижнего края пластинки, ее вынимают из камеры и
дают растворителю испариться в течение 5 мин. Последующее
хроматографирование проводят в том же
направлении, что и импрегнирование.
Приготовление смеси жирных кислот. К 2 г масла
прибавляют 30 мл 0.5 M раствора калия гидроксида
спиртового и нагревают с обратным холодильником в
течение 45 мин. Прибавляют 50 мл воды Р, оставляют
до охлаждения, переносят в делительную воронку
и встряхивают с тремя порциями эфира Р, по 50 мл
каждая. Эфирные слои отделяют, водный слой подкисляют
кислотой хлороводородной P и вновь встряхивают
с тремя порциями эфира Р, по 50 мл каждоя.
Все эфирные слои объединяют и встряхивают с тремя
порциями воды Р, по 10 мл каждая, отбрасывая промывные
воды. Объединенные эфирные слои высушивают
над натрия сульфатом безводным P и фильтруют.
Затем эфир выпаривают на водяной бане, а из
остатка готовят испытуемый раствор. Жирные кислоты
также можно извлечь из раствора, полученного в
ходе определения неомыляемых веществ.
Испытуемый раствор. 40 мг смеси жирных кислот,
полученной из испытуемого масла, растворяют в 4 мл
хлороформа Р.
Раствор сравнения. 40 мг смеси жирных кислот, полученной
из смеси 19 объемов кукурузного масла P
и 1 объема рапсового масла Р, растворяют в 4 мл
хлороформа Р.
Но линию старта хроматографической пластинки наносят
по 3 мкл каждого раствора. Помещают пластинку
в камеру с системой растворителей: вода P -
кислота уксусная ледяная P (10:90). Когда фронт растворителей
пройдет 8 см от линии старта, пластинку
вынимают из камеры, высушивают при температуре
110 0C в течение 10 мин и оставляют до охлаждения.
Затем при отсутствии других указаний в частной
статье пластинку помещают в закрытую плотно
подогнанной крышкой хроматографическую камеру,
предварительно насыщенную парами йода (на дно
камеры в выпарительной чашке помещен йод PJ. Через
некоторое время проявляются коричневые или желтовато-
коричневые пятна. Пластинку вынимают из камеры
и оставляют на несколько минут. Когда коричневый
фон исчезнет, пластинку опрыскивают раствором
крахмала Р. Появляющиеся синие пятна могут
приобретать коричневую окраску при высушивании и
вновь становятся синими после опрыскивания водой Р.
Но хроматограмме испытуемого раствора всегда должны
обнаруживаться пятно с около 0.5 (олеиновая
кислота) и пятно с A?f около 0.65 (линолевая кислота),
соответствующие пятнам на хроматограмме раствора
сравнения. На хроматограммах некоторых масел
может обнаруживаться пятно с R{ около 0.75 (линоле-
новая кислота). Путем сравнения пятен на хроматограмме
испытуемого раствора с пятнами на хроматограмме
раствора сравнения убеждаются в отсутствии
на хроматограмме испытуемого раствора пятна с R^
около 0.25 (эруковая кислота).
2.4.22. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА
ЖИРНЫХ КИСЛОТ МЕТОДОМ
ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Испытание на посторонние масла проводят методом
газовой хроматографии [2.2.28] путем перевода жирных
кислот, содержащихся в испытуемом масле, в метиловые
эфиры.
МЕТОД А
Этот метод неприменим для масел, содержащих гли-
цериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, цик-
лопропиловыми или циклопропениловыми группами,
также для масел, в составе которых большая часть
жирных кислот имеет длину цепи менее восьми атомов
углерода, и для масел с кислотным числом более
2.0.
Испытуемый раствор. Испытуемое масло высушивают
перед метилированием, если это указано в частной
статье. 1.0 г масла помещают в круглодонную колбу
вместимостью 25 мл со шлифом, снабженную обратным
холодильником и газоотводной трубкой. В колбу
прибавляют 10 мл метанола безводного Р, 0.2 мл
раствора 60 г/л калия гидроксида P в метаноле P1
присоединяют обратный холодильник и, пропуская через
смесь азот P со скоростью около 50 мл/мин,
встряхивают и нагревают до кипения. Когда раствор
станет прозрачным (обычно через 10 мин), продолжают
нагревание в течение последующих 5 мин. Затем
колбу охлаждают под проточной водой и содержимое
переносят в делительную воронку. Колбу промывают
5 мл гептана Р, переносят смывы в ту же
делительную воронку и встряхивают. Прибавляют
10 мл раствора 200 г/л натрия хлорида P и энергично
встряхивают. Оставляют до расслоения, затем
переносят органический слой в сосуд, содержащий
натрия сульфат безводный P и через некоторое время
фильтруют.
Раствор сравнения (а). Готовят 0.50 г смеси веществ,
применяемых для калибровки (калибровочной смеси),
состава, приведенного в одной из Табл. 2.4.22, в соответствии
с указаниями в частной статье (если в частной
статье не указан определенный раствор, готовят
смесь состава, приведенного в Табл. 2.4.22.-1). Смесь
растворяют в гептане P и доводят объем раствора
тем же растворителем до 50.0 мл.
Раствор сравнения (b). 1.0 мл раствора сравнения (а)
доводят гептаном P до 10.0 мл.
Раствор сравнения (с). 0.50 г смеси СО Г. PK метиловых
эфиров жирных кислот, соответствующая составу
смеси жирных кислот испытуемого вещества,
указанному в частной статье, растворяют в гептане P
и доводят до объем раствора тем же растворителем
до 50.0 мл. Допускается также использование коммерческой
смеси метиловых эфиров жирных кислот.
Хроматографирование проводят на газовом хроматографе
с пламенно-ионизационным детектором в
следующих условиях:
- колонка капиллярная стеклянная или кварцевая длиной
10-30 м и внутренним диаметром 0.2-0.8 мм,
внутренняя поверхность которой покрыта слоем по-
ли[(цианопропил)(метил)][(фенил) (метил)]силоксана P
или макрогола 20 ООО Pc толщиной слоя 0.1-0.5 мкм
или другой подходящей неподвижной фазой;
- газ-носитель гелий для хроматографии P или водород
для хроматографии Р;
- скорость газа-носителя 1.3 мл/мин (для колонки с
внутренним диаметром 0.32 мм);
- деление потока 1:100 или менее в зависимости от
внутреннего диаметра применяемой колонки (в случае
использования колонки с внутренним диаметром
0.32 мм деление потока должно составлять 1:50);
- температура колонки 160-200 0C, в зависимости
от длины колонки и используемой неподвижной фазы
(для колонки длиной 30 м, покрытой слоем макрогола
20 000 Р, температура должна составлять 200 °С);
- температура устройства ввода проб и детектора
250 0C
- объем вводимой пробы 1 мкл.
При необходимости или если указано в частной статье,
температуру колонки увеличивают от 170 0C до
230 0C со скоростью 3 °С/мин (для колонки, покрытой
слоем макрогола 20 ООО Pl
Хроматографируют 1 мкл раствора сравнения (о).
Чувствительность системы регулируют таким образом,
чтобы высота основного пика на полученной хроматограмме
составляла от 50 % до 70 % шкалы регистрирующего
устройства.
Хроматографическая система считается пригодной,
если при использовании смеси веществ, применяемых
для калибровки, приведенных в Табл. 2.4.22.-1 или
2.4.22.-3, выполняются следующие условия:
- на хроматограмме раствора сравнения (а) коэффициент
разделения пиков, соответствующих метилоле-
ату и метилстесрату, составляет не менее 1.8;
- на хроматограмме раствора сравнения (Ь) отношение
сигнал/шум для пик-а метилмиристата составляет
не менее 5.
- на хроматограмме раствора сравнения (а) число
теоретических тарелок, вычисленное для пика, соответствующего
метилстеарату, составляет не менее
30 000.
Хроматографическая система считается пригодной,
если при использовании смеси веществ, применяемых
для калибровки, приведенных в Табл. 2.4.22.-2, выполняются
следующие условия:
- на хроматограмме раствора сравнения (а) коэффициент
разделения пиков, соответствующих метилкап-
рилату и метилкапрату, составляет не менее 4.0;
- на хроматограмме раствора сравнения (о) отношение
сигнал/шум для пика метилкапроата составляет
не менее 5;
- на хроматограмме раствора сравнения (а) число
теоретических тарелок, вычисленное для пика, соответствующего
метилкапрату, составляет не менее
15 000.
ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАММ
Следует избегать условий хроматографирования, которые
могут дать неразделенные пики (наличие компонентов
с небольшим различием между временами
удерживания, например, линоленовая и арахидоно-
вая кислоты).
Качественный анализ. Идентификацию пиков проводят
по хроматограмме раствора сравнения (с); также
по калибровочной кривой при использовании хроматограммы
раствора сравнения (а) и данных Табл.
2.4.22.-1, 2.4.22.-2 и 2.4.22.-3:
а) для хроматограмм, полученных в изотермическом
режиме, вычисляют логарифмы приведенных времен
удерживания как функцию эквивалента числа атомов
углерода в жирных кислотах. Калибровочная кривая
насыщенных кислот представляет собой прямую линию.
Логарифмы приведенных времен удерживания
ненасыщенных кислот расположены на этой линии как
точки, соответствующие не целым значениям «эквивалента
длины цепи». Идентификацию компонентов жирных
кислот испытуемого масла проводят, рассчитывая
логарифмы приведенных времен удерживания пиков,
полученных на хроматограмме испытуемого раствора,
и устанавливая по калибровочной кривой «эквиваленты
длины цепи»;
б) для хроматограмм, полученных с использованием
линейного градиента температуры, определяют времена
удерживания, находящиеся в зависимости от
числа атомов углерода в жирных кислотах, и идентифицируют
жирные кислоты, входящие в состав испытуемого
масла, путем сравнения с калибровочной
кривой.
Количественный анализ. Обычно используют
метод внутренней нормализации; при этом сумму площадей
всех пиков на хроматограмме, кроме пиков,
относящихся к растворителю, принимают за 100 %.
Содержание каждого компонента вычисляют как отношение
площади соответствующего пика к сумме
площадей всех пиков. Пики, площадь которых составляет
менее 0.05 % от суммы площадей всех пиков, не
учитывают при отсутствии других указаний в частной
статье.
В определенных случаях, т.е. при наличии жирных кислот
с 12 или менее атомами углерода, в частной статье
должен быть указан поправочный коэффициент
для преобразования площадей пиков в проценты
(м/м).
МЕТОД В
Этот метод неприменим для масел, содержащих гли-
цериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, цик-
лопропиловыми и циклопропениловыми группами и для
масел с кислотным числом более 2.0.
Испытуемый раствор. 0.100 г испытуемого вещества
помещают в центрифужную пробирку с завинчивающейся
крышкой, растворяют в 1 мл гептана P и 1 мл
диметилкарбоната P и энергично перемешивают при
умеренном нагревании (50-60 0C). К еще тепломул,
раствору прибавляют 1 мл раствора 12 г/л натрия-
P в метаноле безводном P1 приготовленного с необходимыми
предосторожностями, и энергично перемешивают
в течение 5 мин. Прибавляют 3 мл воды
дистиллированной P и энергично перемешивают в
течение 30 с. Центрифугируют в течение 15 мин с
ускорением 1500 д. Хроматографируют 1 мкл органического
слоя.
Растворы сравнения и оценка хроматограмм. При
отсутствии других указаний в частной статье поступают
в соответствии с указаниями в Методе А.
Хроматографирование проводят на газовом хроматографе
с пламенно-ионизационным детектором в
следующих условиях:
- колонка кварцевая длиной 30 м, с внутренним диаметром
0.25 мм, покрытая слоем макрогола 20 ООО P
толщиной 0.25 мкм;
- газ-носитель гелий для хроматографии Р;
- скорость газа-носителя 0.9 мл/мин;
_ деление потока 1:100;
~ объем вводимой пробы 1 мкл.
Используют следующую программу температурного
режима:
Время
(мин)
Температура
(0C)
Колонка
0-15 100 15-36 1 0 0 ^
->225
36-61 225
Устройство ввода проб 250
Детектор 250
МЕТОД С
Этот метод неприменим для масел, содержащих гли-
цериды жирных кислот с э по к си-, гидроперекисными,
альдегидными, кетоновыми, циклопропиловыми и цик-
лопропениловыми группами и сопряженными полиненасыщенными
и ацетиленовыми компонентами из-за
частичного или полного разрушения этих групп.
Испытуемый раствор. 0.10 г испытуемого вещества
помещают в коническую колбу вместимостью 25 мл,
растворяют в 2 мл раствора 20 г/л натрия гидроксида
P в метаноле P и кипятят с обратным холодильником
в течение 30 мин. Затем через холодильник прибавляют
2.0 мл раствора бора трифторида в метаноле
Pw кипятят еще 30 мин, после чего прибавляют
через холодильник 4 мл гептана P и кипятят 5 мин.
Охлаждают, прибавляют 10.0 мл раствора натрия
хлорида насыщенного Р, встряхивают в течение 15 с
и прибавляют такой объем раствора натрия хлорида
насыщенного P1 чтобы верхний слой поднялся к горлу
колбы. Отбирают 2 мл верхнего слоя, помещают в
делительную воронку, промывают тремя порциями
воды Р, по 2 мл каждая, и высушивают над натрия
сульфатом безводным Р.
Растворы сравнения, хроматографическая методика
и оценка хроматограмм. При отсутствии других указаний
в частной статье поступают в соответствии с
указаниями в Методе А.
Табл. 2.4.22.-1
Смесь веществ, применяемых для калибровки 1,1
Состав (в процентах м/м)
Смесь из следующих
веществ
Эквивалент длины
цепи ( г )
Изотермический
режим
Линейный градиент
температуры
Метиллаурат P 12.0 5 10
Метилмиристат P 14.0 5 15
Метилпальмитат P 16.0 10 15
Метилстеарат P 18.0 20 20
Метиларахидат P 20.0 40 20
Метилолеат P 18.3 20 20
111 Для ГХ с применением капиллярной колонки и делением потока рекомендуется прибавлять к смеси веществ, применяемых для калибровки,
компоненты с большей длиной цепи.
151 Эти значения, вычисленные с использованием калибровочной кривой, даны в качестве примера для колонки, покрытой слоем мокрого-
ло 20 ООО Р.
Табл. 2.4.22.-2
Смесь веществ, применяемых для калибровки
Состав (в процентах м/м)
Смесь из следующих
веществ
Эквивалент длины
цепи m
Изотермический
режим
Линейный градиент
температуры
Метилкапроат P 6.0 5 10
Метилкаприлат P 8.0 5 35
Метилкапрат P 10.0 10 35
Метиллаурат P 12.0 20 10
Метилмиристат P 14.0 40 10
Табл. 2.4.22.-3
Смесь веществ, применяемых для калибровки 1,1
Состав (в процентах м/м)
Смесь из следующих
веществ
Эквивалент длины
цепи ( 2 )
Изотермический
режим
Линейный градиент
температуры
Метилмиристат P 14.0 5 15
Метилпальмитат P 16.0 10 15
Метилстеарат P 18.0 15 20
Метиларахидат P 20.0 20 15
Метилолеот P 18.3 20 15
Метилэйкозаноат P 20.2 10 10
Метилбегенат P 22.0 10 5
Метиллигноцерат P 24.0 10 5
1 4 Для ГХ с применением капиллярной колонки и делением потока рекомендуется прибавлять к смеси веществ, применяемых для калибровки,
компоненты с большей длиной цепи.
и Эти значения, вычисленные с использованием калибровочной кривой, даны в качестве примера для колонки, покрытой слоем макрогола
20 ООО Р.
МЕТОД А
Допускается применение других методик перевода
содержащихся в испытуемом масле жирных кислот в
метиловые эфиры, указанных в частной статье.
ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАММ
Качественный анализ
а) Допускается идентификация жирных кислот испытуемого
масла путем сравнения времен удерживания
пиков на хроматограмме испытуемого раствора с
временами удерживания пиков на хроматограмме
раствора сравнения или на стандартной хроматограмме,
описанной в частной статье.
Приведенное время удерживания - разница между
временем удерживания пика вещества и временем
удерживания несорбирующегося (в условиях определения)
вещества.
2.4.23. СТЕРИНЫ В ЖИРНЫХ МАСЛАХ
ОТДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВОЙ ФРАКЦИИ
Получают неомыляемые вещества жирного масла и
затем отделяют стериновую фракцию методом тонкослойной
хроматографии (2.2.27), используя пластинки,
покрытые тонким слоем силикагеля G P толщиной
от 0.3 мм до 0.5 мм.
Испытуемый раствор (а). В колбу вместимостью 150 мл,
снабженную обратным холодильником, помещают
раствор 2 г/л бетулина P в метиленхлориде P в таком
объеме, чтобы количество бетулина соответствовало
около 10 % содержания стеринов в образце,
взятом для определения (т.е. в случае оливкового масла
прибавляют 500 мкл, в случае других растительных
масел - 1500 мкл раствора бетулина). Выпаривают
до сухого остатка под азотом Р. Если в частной статье
определяется только содержание индивидуальных
стеринов в процентах к стериновой фракции, раствор
бетулина можно не прибавлять.
В колбу помещают 5.00 г испытуемого вещества.
Прибавляют 50 мл 2 M раствора калия гидроксида
спиртового P и нагревают на водяной бане в течение
1 ч, часто перемешивая содержимое колбы круговыми
движениями. Охлаждают до температуры ниже
250C и количественно переносят содержимое колбы
в делительную воронку, содержащую 100 мл воды Р.
Осторожно встряхивают с тремя порциями эфира,
свободного отпероксидов Р, по 100 мл каждая. Эфирные
слои собирают в другую делительную воронку,
содержащую 40 мл воды Р, слегка встряхивают в течение
нескольких минут, оставляют до расслоения и
отбрасывают водный слой. Эфирный слой встряхивают
с несколькими порциями воды Р, по 40 мл каждая,
до тех пор, пока водный слой не перестанет давать
щелочную реакцию по фенолфталеину. Эфирный слой
количественно переносят в колбу, высушенную до
постоянной массы, промывая делительную воронку
эфиром, свободным от пероксидов Р. Эфир выпаривают
с необходимыми предосторожностями, к остатку
прибавляют 6 мл ацетона Р. Осторожно удаляют
растворитель подтоком азота Р. Высушивают до постоянной
массы при температуре от 100 0C до 105 0C,
охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Остаток растворяют
в минимальном объеме метиленхлорида Р.
Испытуемый раствор (b). В колбу вместимостью 150 мл,
снабженную обратным холодильником, помещают
5.00 г рапсового масла P и далее поступают в соответствии
с указаниями в приготовлении испытуемого
раствора (а), начиная со слов «Прибавляют 50 мл
2 M раствора калия гидроксида спиртового Р».
Испытуемый раствор (с) В колбу вместимостью 150 мл,
снабженную обратным холодильником, помещают
5.00 г подсолнечного масла P и далее поступают в
соответствии с указаниями в приготовлении испытуемого
раствора (а), начиная со слов «Прибавляют 50 мл
2 M раствора калия гидроксида спиртового Р».
Раствор сравнения. 25 мг холестерина P и 10 мг
бетулина P растворяют в 1 мл метиленхлорида Р.
Для каждого испытуемого раствора используют отдельную
пластинку. На каждую из пластинок наносят
полосой размером (20x3) мм 20 мкл раствора сравнения
и полосой размером (40x3) мм 400 мкл испытуемого
раствора (а), испытуемого раствора (о), или
испытуемого раствора (с), соответственно. Пластинки
помещают в камеру с системой растворителей эфир
P - гексан P(35:65). Когда фронт растворителей пройдет
18 см от линии старта, пластинки вынимают из
камеры, высушивают в токе азота Р, опрыскивают
раствором 2 г/л дихлорфлуоресцеина PB этаноле P
и просматривают в ультрафиолетовом свете при длине
волны 254 нм. На хроматограмме раствора сравнения
обнаруживаются полосы, соответствующие холестерину
и бетулину. На хроматограммах испытуемых
растворов обнаруживаются полосы с близкими
значениями R1 , соответствующие стеринам. С хроматограммы
каждого испытуемого раствора снимают область
покрытия, на которой расположены полосы стеринов,
а также дополнительно зоны на 2-3 мм выше
и ниже видимых зон раствора сравнения и помещают
раздельно в три колбы вместимостью 50 мл каждая.
В каждую колбу прибавляют по 15 мл теплого метиленхлорида
P и встряхивают. Каждый раствор фильтруют
через стеклянный фильтр (40) или подходящую
фильтровальную бумагу и промывают каждый фильтр
тремя порциями метиленхлорида Р, по 15 мл каждая.
Объединенные фильтраты и смывы помещают в три
колбы, высушенные до постоянной массы, выпаривают
до сухого остатка под током азота P и взвешивают.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВ
Определение стеринов проводят методом газовой
хроматогра фии (2.2.28).
Все операции проводят, защищая растворы и реактивы
от влаги, растворы готовят непосредственно перед
применением.
Испытуемый раствор. К выделенным из испытуемого
вещества методом тонкослойной хроматографии стеринам
прибавляют свежеприготовленную смесь: хлор-
триметилсилан P - гексаметилдисилазан P - пиридин
безводный P (1:3:9). (0.02 мл смеси на миллиграмм
остатка). Осторожно встряхивают до полного растворения
остатка и оставляют в эксикаторе над
фосфоро/V) оксидом P на 30 мин. При необходимости
центрифугируют и используют надосадочную жидкость.
Раствор сравнения (а). К 9 частям стеринов, выделенных
из рапсового мосла Яметодом тонкослойной хроматографии,
прибавляют 1 часть холестерина Р. К
полученной смеси прибавляют свежеприготовленную
смесь: хлортриметилсилан P - гексаметилдисилазан P
- пиридин безводный P (1:3:9) (0.02 мл смеси на миллиграмм
остатка). Осторожно встряхивают до полного
растворения остатка и оставляют в эксикаторе над
фосфора(У) оксидом Pна 30 мин. При необходимости
центрифугируют и используют надосадочную жидкость.
Раствор сравнения (Ь). К стеринам, выделенным из
подсолнечного масла P методом тонкослойной хроматографии,
прибавляют свежеприготовленную смесь:
хлортриметилсилана P - гексаметилдисилазан - пиридин
безводный P (1:3:9) (0.02 мл смеси на миллиграмм
остатка). Осторожно встряхивают до полного
растворения остатка и оставляют в эксикаторе над
фосфора(У) оксидом P на 30 мин. При необходимости
центрифугируют и используют надосадочную жидкость.
Хроматографирование проводят на газовом хроматографе
с пламенно-ионизационным детектором в
следующих условиях:
- колонка капиллярная кварцевая длиной от 20 м до
30 м и внутренним диаметром от 0.25 мм до 0.32 мм,
покрытая поли[метил(95}фенил(5)]силоксаном P или
поли[метил(94}фенил(5)винил(1)]силоксаном Pc толщиной
слоя 0.25 мкм,
- гоз-носитель водород для хроматографии /-'(линейная
скорость от 30 см/с до 50 см/с) или гелий для
хроматографии P (линейная скорость от 20 см/с до
35 см/с). Линейную скорость измеряют следующим
способом: в условиях определения стеринов вводят
от 1 мкл до 3 мкл метана или пропана. Измеряют
время в секундах, необходимое для прохождения газа
через колонку от момента введения до появления пика
(/J. Линейную скорость вычисляют по формуле L/t
где / - длина колонки в сантиметрах;
- деление потока 1:50 или 1:100;
- температура колонки 260 0C;
- температура устройства ввода проб 280 0C;
- температура детектора 290 0C
Хроматографируют в указанных условиях по 1 мкл
каждого раствора.
На хроматограмме раствора сравнения (а) обнаруживается
четыре основных пика, соответствующих
холестерину, брассикастерину, кампестерину и .-си-
тостерину; на хроматограмме раствора сравнения (Ь)
обнаруживается четыре основных пика, соответствующих
кампестерину, стигмастерину, .-ситостерину и
Д7-сигмастенолу. Времена удерживания стеринов относительно
.-ситостерина даны в Табл. 2.4.23.-1.
Пик внутреннего стандарта (бетупин) должен быть четко
отделен от пиков определяемых стеринов.
Идентифицируют пики, обнаруженные на хроматограмме
испытуемого раствора, и вычисляют процентное
содержание каждого стерина в стериновой.фракции
испытуемого вещества по формуле:
S-
--100 ,
.5.
где
S ~ площадь пика, соответствующего
определяемому компоненту;
.5 - сумма площадей всех пиков, соответствующих
компонентам, указанным в Табл. 2.4.23.-1.
При наличии указания в частной статье, вычисляют
количество каждого стерина, содержащееся в 100 г
испытуемого вещества, в миллиграммах, по формуле:
5 /г? • 100
5
S • m
s
где
S- площадь пика, соответствующего определяемому
компоненту;
S5 ~ площадь пика, соответствующего бетулину;
m - масса навески образца испытуемого вещества, в
граммах;
ms - масса прибавленного бетулина P в миллиграммах.
Таблица 2.4.23.-1
Времена удерживания стеринов по отношению к времени удерживания
. -ситостерина для двух различных колонок
Поли[метил(95)-
фенил(5)]силоксан
Поли[метил(94)фенил(5)-
винил( 1 )]силоксан
Холестерин 0.63 0.67
Брассикастерин 0.71 0.73
24-Метиленхолестерин 0.80 0.82
Кампестерин 0.81 0.83
Кампестанол 0.82 0.85
Стигмастерин 0.87 0.88
Д7-Кампестерин 0.92 0.93
Д5,23-Стигмастадиенол 0.95 0.95
Клеростерин 0.96 0.96
.-Ситостерин 1 1
Ситостанол 1.02 1.02
Д5-Авенастерин 1.03 1.03
Д5,24-Стигмастадиенол 1.08 1.08
А7-Стигмастенол 1 ,1 1.12 1.12
Д7-Авенастерин 1.16 1.16
Бетулин 1.4 1.6
В литературе данный стерин может также быть отнесен к 07-Стигмастерину.
2.4.24. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОНТРОЛЬ
ОСТАТОЧНЫХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ
Методики испытаний, описанные в общем методе,
могут быть использованы:
IJ для идентификации большинства остаточных растворителей
Класса 1 и Класса 2 в субстанции, вспомогательном
веществе или готовом продукте, если остаточные
растворители неизвестны;
2) для определения предельного содержания остаточных
растворителей Класса 1 и Класса 2 в субстанции,
вспомогательном веществе или готовом продукте;
3) для количественного определения растворителей
Класса 2 при их предельном содержании более чем
Ю-' млн"' (0.1 %) или, при необходимости, для количественного
определения растворителей Класса 3.
Остаточные растворители Класса 1, Класса 2 и Класса
3 представлены в общей статье 5.4. «Остаточные количества
органических растворителей».
Описаны три растворителя для приготовления испытуемого
образца и условий парофазного введения
паровой фазы образца в хроматографическую систему.
Описаны две хроматогрофические системы, из которых
система А является предпочтительной, система В
обычно предназначена для подтверждения подлинности.
Выбор процедуры приготовления испытуемого
образца зависит от растворимости испытуемого вещества
и определяемых остаточных растворителей.
Остаточные растворители, которые с трудом могут
быть определены в условиях парофазного ввода паровой
фазы образца: формамид, 2-этоксиэтанол,
2-метоксиэтанол, этиленгликоль, /V-метилпирролидон
и сульфолан. Для анализа указанных остаточных растворителей
следует применять другие подходящие процедуры.
Если методика анализа применяется для количественного
контроля остаточных растворителей в субстанции,
она должна быть валидирована.
ИСПЫТАНИЕ
Определение проводят методом газовой хроматографии
со статическим вводом паровой фазы (2.2.28).
Приготовление образца 1. Предназначен для
контроля остаточных растворителей в водорастворимых
веществах.
Приготовление испытуемого раствора (J). 0.200 г испытуемого
вещества растворяют в воде P и доводят
до объема 20.0 мл тем же растворителем.
Приготовление образца 2. Предназначен для
контроля остаточных растворителей в нерастворимых
в воде веществах.
Приготовление испытуемого раствора (2). 0.200 г испытуемого
вещества растворяют в .,.-диметилфор-
камиде P (ДМФ) и доводят до объема 20.0 мл тем же
растворителем.
Приготовление образца 3. Предназначен для
контроля точно известных или предполагаемых .,.-
диметилацетамида и/или .,.- диметилформамида в
испытуемом веществе.
Приготовление испытуемого раствора (3). 0.200 г испытуемого
вещества растворяют в I,З-диметил-2-ими-
дозолидинона P (ДМИ) и доводят до объема 20.0 мл
тем же растворителем.
8 некоторых случаях, когда ни один из вышеуказанных
методов приготовления образца не является подходящим,
тогд;. подбирают для конкретного образца
соответствующие растворитель и условия статического
ввода паровой фазы.
Роствор растворителя (а). К 1.0 мл раствора СО Г.
PK остаточного растворителя Класса 1 прибавляют
9 мл диметилсульфоксида P и доводят до объема
100.0 мл водой Р. 1.0 мл полученного раствора доводят
до объема 100 мл водой Р. 1.0 мл полученного
раствора доводят до объема 10.0 мл водой Р.
Ниже указаны пределы остаточных растворителей в
растворе СО ГФ PK
- бензол: 2 млн'1;
- четыреххлористый углерод: 4 млн'1;
- 1,2-дихлорэтан: 5 млн"1;
- 1,1-дихлорэтен: 8 млн"1;
- 1,1,1-трихлорэтан: 10 млн'1.
Раствор растворителя (Ь). Соответствующее количество
остаточных растворителей Класса 2 растворяют
в диметилсульфоксиде P и доводят до объема
100.0 мл водой Р. Полученный раствор разбавляют
до концентрации 1/20 от предельного содержания,
указанного в Табл. 2 (см. 5.4. «Остаточные количества
органических растворителей»).
Раствор растворителя (с). 1.00 г растворителя или
растворителей, содержащихся в испытуемом веществе,
растворяют в диметилсульфоксиде P или воде Р, соответственно,
и доводят до объема 100.0 мл водой Р.
Полученный раствор разбавляют до концентрации
1 /20 от предельного содержания, указанного в Табл.
1 или 2 (см. 5.4. «Остаточные количества органических
растворителей^.
Компенсационный раствор. Готовят в условиях, описанных
для раствора растворителя (с), но без прибавления
растворителя (растворителей) (используется
для подтверждения отсутствия мешающих пиков).
Испытуемый раствор. 5.0 мл испытуемого раствора и
1.0 мл компенсационного раствора помещают в контейнер.
Раствор сравнения (а) (Класс I). 1.0 мл раствора растворителя
(а) и 5.0 мл соответствующего растворителя
помещают в контейнер.
Роствор сравнения (a J (Класс IJ 5.0 мл испытуемого
раствора и 1.0 мл раствора растворителя (а) помещают
в контейнер.
Раствор сравнения (Ь) (Класс 2). 1.0 мл раствора растворителя
(Ь) и 5.0 мл соответствующего растворителя
помещают в контейнер.
Раствор сравнения (с). 5.0 мл испытуемого раствора
и 1.0 мл раствора растворителя (с) помещают в контейнер.
Раствор сравнения (dj. 1.0 мл компенсационного раствора
и 5.0 мл соответствующего растворителя помещают
в контейнер.
Контейнеры плотно укупоривают резиновой мембранной
крышкой, покрытой политетрафторэтиленом
и обвальцовывают алюминиевой крышкой. Встряхивают
содержимое контейнера до получения гомогенного
раствора.
В представленной ниже таблице указывают условия
статического ввода паровой фазы:
Рабочий параметр
Процедура приготовления
испытуемого образца
1 2 3
Температура уравновешивания (0C) 80 105 80
Время уравновешивания (мин) 60 45 45
Температура блока ввода паровой пробы (0C) 85 110 105
Газ-носитель: азот для хроматографии P или гелий для хроматографии P пои соответствующем давлении
Время напуска газа-носителя в контейнер
с анализируемой пробой, С 30 30 30
Объем ввода паровой пробы, мл 1 1 1
Хроматографирование выполняют, применяя систему
А или в случае влияния матрицы, систему В.
СИСТЕМА А
- кварцевая капиллярная колонка или колонка с широким
отверстием, длиной 30 м и внутренним диаметром
0.32 мм или 0.53 мм, покрытая пленкой поперечно-
сшитых полицианопропилфенилсилоксана и поли-
диметилсилоксана (6 % и 94 %, соответственно; толщина
пленки 1.8 мкм или 3 мкм);
- газ-носитель: азот для хроматографии P или гелий
для хроматографии P1 деление потока 1:5 с линейной
скоростью около 35 см/с;
- пламенно-ионизационный детектор (для хлорированных
остаточных растворителей Класса 1 может быть
также использован масс-спектрометр или электроно-
захватный детектор);
- температуру колонки программируют: поддерживают
температуру колонки 40 0C в течение 20 мин, затем
повышают температуру до 240 °С со скоростью
10 0C /мин, температуру 240 0C выдерживают в течение
20 мин;
- температура устройства ввода проб 140 °С;
- температура детектора 250 °С.
СИСТЕМА В
- кварцевая капиллярная колонка или колонка с широким
отверстием, длиной 30 м и внутренним диаметром
0.32 мм или 0.53 мм, покрытая слоем макрогола
20000 P толщиной 0.25 мкм;
- газ-носитель: азот для хроматографии P или гелий
для хроматографии Р, деление потока 1:5 с линейной
скоростью около 35 см/с;
- пламенно-ионизационный детектор (для хлорированных
остаточных растворителей Класса 1 может быть
также использован масс-спектрометр или электроно-
захватный детектор);
- температуру колонки программируют: 50 0C в течение
20 мин, повышение температуры со скоростью
6 0C /мин до 165 0C, температуру 165 0C выдержи-
воют в течение 20 мин;
- температура устройства ввода проб 140 0C;
- температура детектора 250 °С.
Хроматографируют 1 /ил паровой фазы раствора сравнения
(а), используя колонку, описанную в системе А
и определяют отношение сигнал/шум для пика 1,1,1
- трихлорэтана. Отношение сигнал/шум должно быть
не менее 5. Типичные хроматограммы представлены
на Рис 2.4.24.-1.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы раствора сравнения
(aj, используя колонку, описанную в системе А.
На хроматограмме должны обнаруживаться пики остаточных
растворителей Класса 1.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы раствора сравнения
(Ь), используя колонку, описанную в системе А
и определяют коэффициент разделения пиков ацето-
нитрила и метиленхлорида. Система считается пригодной,
если полученная хроматограмма имеет сходство
с хроматограммой, представленной на Рис.
2.4.24.-2 и коэффициент разделения пиков ацетонит-
рила и метиленхлорида не менее 1.0.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы испытуемого
раствора, используя колонку, описанную в системе А.
Испытуемое вещество не содержит остаточных растворителей,
если на хроматограмме испытуемого
раствора отсутствуют пики, соответствующие пикам
остаточных растворителей на хроматограммах растворов
сравнения (а) или (Ь). Если на хроматограмме
испытуемого раствора обнаруживается пик, соответствующий
пику любого остаточного растворителя на
хроматограммах растворов сравнения (а) или (Ь), то
применяют систему В.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы раствора
сравнения (а), используя колонку, описанную в системе
В и определяют отношение сигнал/шум для пика
бензола. Отношение сигнал/шум должно быть не
менее 5. Типичные хроматограммы представлены на
Рис. 2.4.24.-3.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы раствора сравнения
(aj, используя колонку, описанную в системе В.
На хроматограмме должны обнаруживаться пики остаточных
растворителей Класса 1.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы раствора сравнения
(Ь), используя колонку, описанную в системе В
и определяют коэффициент разделения пиков ацето-
нитрила и трихлорэтена. Система считается пригодной,
если полученная хроматограмма имеет сходство
с хроматограммой, представленной на Рис. 2.4.24.-4
и коэффициент разделения пиков ацетонитрила и
трихлорэтена не менее 1.0.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы испытуемого
раствора, используя колонку, описанную в системе В.
Испытуемое вещество не содержит остаточных растворителей,
если на хроматограмме испытуемого
раствора отсутствуют пики, соответствующие пикам
остаточных растворителей на хроматограммах растворов
сравнения (а) или (Ь). Если на хроматограмме
испытуемого раствора обнаруживается пик, соответствующий
пику любого остаточного растворителя на
хроматограммах растворов сравнения (а) или (Ь),
обнаруживаемый также при использовании системы
А, поступают следующим образом.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы раствора сравнения
(с), используя колонку, описанную в системе А
или В. При необходимости чувствительность системы
регулируют таким образом, чтобы высота пика определяемого
остаточного растворителя (растворителей)
но полученной хроматограмме составляла не менее
50 % от полной шкалы регистрирующего устройство.
Хроматографируют 1 мл паровой фазы раствора сравнения
(а). Не должны наблюдаться мешающие пики.
Хроматографируют по 1 мл паровой фазы испытуемого
раствора и раствора сравнения (с). Повторно
вводят эти растворы более 2 раз.
Площадь пика остаточного растворителя (растворителей)
на хроматограмме испытуемого раствора не
должна превышать половины площади пика остаточного
растворителя (растворителей) на хроматограмме
раствора сравнения (с). Результаты анализа считаются
достоверными, если относительное стандартное
отклонение, рассчитанное для площадей пиков
растворителей на трех хроматограммах раствора
сравненения (с) и испытуемого раствора не более 15 %.
Диаграмма процедуры анализа представлена на Рис.
2.4.24.-5.
Если остаточные растворители Класса 2 или Класса
3 составляют 0.1 % и более, то их количественное
содержание может быть определено методом использования
стандартов.
Новости